Name: 迅速な分別とコミュニティベースの設定から得られた試料中の全血液成分の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶ全血試料からのDNA、RNA、PBMC、血清、血漿の迅速な単離法。遠心分離とフィルタリングを用いたハイスループット処理により、非臨床環境で高品質な血液成分を効率的に分離します。

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私たちは、細部への貴重な注意と採血の処理に費やした時間に対して、Henriette Mair-Meijersに感謝したいと思います。ナタリー・ジェイムソン・キースリングのグラフィックデザインの専門知識に感謝しています。また、ここに記載されているメーカー(Qiagen(カリフォルニア州バレンシア)、BD Biosciences(カリフォルニア州サンノゼ)、Life Technologies(ニューヨーク州グランドアイランド))の承認を得て、説明されている製品の使用を公開していただきありがとうございます。この研究のための資金は、国立衛生研究所の賞番号DA022720、RC1MH088283、およびDA022720-05-S1によって寛大に提供されました。

<ol><li>Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+selective+serotonin-reuptake+inhibitors+on+lymphocyte+subsets+in+patients+with+a+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).</li>
<li>Weigelt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+and+DAP12+expression+in+monocytes+of+patients+with+severe+psychiatric+disorders+EGR3%2C+ATF3+and+PU.1+as+important+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors.</a> Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subset+differences+in+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%2C+multiple+sclerosis+and+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression.</a> Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).</li>
<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea</a> (2010).</li>
<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
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<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf">http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess">http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess</a> (2009).</li>
<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
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<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf">http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf</a> (2012).</li>
<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf">http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf</a> (2006).</li>
<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).</li>
<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
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<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
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<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+AC+%22Distinct+gene+expression+profiles+characterize+lifetime+PTSD+and+childhood+maltreatment+in+the+Detroit+Neighborhood+Health+Study%22">Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study</a>. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する利害を持っていないことを宣言します。

我々は成功し、デトロイト近所健康調査では1,600以上の全血サンプルを処理するために適用されている合理化されたプロトコルを記載しています。これらの技術の多くは、既存の文献で利用可能であるが、各ステップ間の正確なタイミングの変更など、私たちのステップバイステップのコンパイルは、成功した下流のアプリケーションの広い範囲で生物学的標本のさまざまなを生成し、最適化、効率的なプロトコルを反映して、 DNAメチル化、mRNA発現および免疫学的分析を含みます。これらの標本は、すでに実験、査読論文に発表されたおよび/ ​​または国会議11,20,21,23,24,29で発表されたのさまざまな結果でテストされています。このプロトコルは、このようにDNHSに似た集団ベースの研究では、生物学的標本を収集しようとしている他の研究者を対象とすべきです。 このような高throughp内のサンプルを処理する場合UTの方法は、すべての段階で正確な記録を維持するために最も重要です。私たちは、冒頭でクライオバイアルすべての情報を格納するためのデータベースを開発することをお勧めします。このデータベ...

複数の研究が持つと精神（または他の）1-4病気ない個体間の血液中の遺伝子発現、DNAメチル化及び細胞サブセットの違いを特徴としています。これらの研究は、しかしながら、疾患関連の差異が原因で患者が治療を求めている病気の一般的に、より深刻に拡大することができる、臨床現場から得られました。 「オミクス」のアプローチの進歩に、過去十年間は、疾患の有病率の集団ベースの推定値を提供するために、コミュニティおよび/ ​​または疫学的設定5-7からの生物学的サンプルを得ることに興味の爆発とのより広範な絵を見ていますこれらの精神的および/または物理的な病気の環境的決定要因。 この点で重要な課題は、収集した検体の迅速な処理のための必要条件です。単核細胞、frequentlあるキー免疫系の成分の分解yは、個人の健康状態を評価するために使用、コレクション8-10の2時間後の回復の有意な減少と血液採取直後に開始されます。この課題に対処するために、我々は、ヒト全血の複数のコンポーネントを同時に大都市圏に住んでいる被験者の家庭で得られた試​​料から分離されている最適化されたプロトコルを提示します。プロトコルは、将来の技術をさらに分離/分析を可能とするイベント内のすべての "余分な"画分のストレージを含む現在の技術、当社の編集や変更に基づいています。代替方法またはキットは、ここで説明する個々のメソッドの代わりに使用することができるが、概説したものは、ハイスループット様式で処理試料の信頼性が高く効率的な手段であることが証明されています。新鮮な血液の高品質の分画（PBMCを、DNA、血清、およびRNA）は、コレクションの2時間以内に製造することができ、すべての分析に対応した標本は2日以内に利用可能である（ 図1）。 、集団ベース;このプロトコルは、デトロイト近所健康調査（DA022720、RC1MH088283、DA022720-05-S1 DNHS）にテストのためにデトロイトの街の地域在住、大人の住民から採取したサンプルの効率的な処理を可能にするために開発されました心的外傷後ストレス障害（PTSD）の社会的および生物学的決定要因やその他の精神疾患の研究。デトロイトのPTSDの有病率は倍以上の全国平均11,12です。この集団では、PTSDの生物学的決定因子を同定することは、この都市人口で、その他の高リスク集団（例えば、退役軍人を返す）の両方で、障害で苦しむ人々を支援するための適切な薬理学的および/ ​​または認知行動的介入を開発するのを助けることができます。以前にデトロイト、ミシガン州のウェイン州立大学にある研究室では、様々な由来の新鮮な組織サンプルを取り扱うのノウハウに基づいて、処理のために選択されまし​​たソースの、必要性は、コレクションの2時間以内にサンプルを処理を開始し、回収サイトへの私たちの近接。手元にこのユニークな機会を、我々の目標は、各試料からのDNA、RNA、血清および末梢血単核細胞（PBMC）の最大収率（試料採取の5波以上N = 1639サンプルの合計）のための処理を最適化することでした。ここで説明した手順は、このように、マイクロアレイなどの下流のアプリケーションの多数の出発材料（平均収率は 、表1を参照）、エピジェネティックな、リアルタイムRT-PCRを製造する、非臨床環境で同時に実行され、フローサイトメトリー分析を流すことができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700"> 図1.全体的な作業の流れ。ここに描かれ、全体のプロセスは同意気難しいを識別するから血液検体を得るための物流を含み採血自体にipants。高品質の、画分（末梢血単核細胞; PBMCを、DN​​A、血清、及びRNA）新鮮な全血の収集の2時間以内に製造することができ、全てのアッセイ対応標本は2日以内に使用可能であることができます。試料を直ちに試験することがないようにしている場合はさらに、この方法によって調製画分を、長期保存に適しています。ここで説明するタイムライン全体を一日（〜5時間の合計）で完了することができました。しかし、そのような日​​は、特に技術と豊富な経験を持つ単一の技術者のために非常に労働集約的であろう。したがって、我々は、少なくとも二つの技術の間に1日目の手順を分割し、2日目に、RNA処理を完了したお勧めします<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA血液ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>1日目:DNA分離</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>1日目:PBMC分離</td></tr><tr><td>5 &frac34;&rdquo;パスツールピ</td><td>ペットフィ</td><td>ッシャー13-678-6A1</td><td>日目:PBMC分離</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)、熱不活性化</td><td>ライフテクノロジー</td><td>10082147</td><td>1日目:PBMC分離</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマ</td><td>D8418-500ml1</td><td>日目:PBMC分離</td></tr><tr><td>RPMI培地1640、液体</td><td>Invitrogen</td><td>11875119</td><td>1日目:PBMC分離</td></tr><tr><td>0.4%トリパンブルーステイン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>1日目:PBMC単離</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>1日目:PBMC単離</td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counterまたは顕微鏡や血球計算盤などの細胞計数装置</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>1日目:PBMC単離</td></tr><tr><td>LeukoLOCK 分画 &スタビライゼーションキット&nbsp;</td><td>アンビオン</td><td>1933</td><td>1日目:白血球RNA単離</td></tr><tr><td>25&nbsp;G x 5/8インチ針</td>ベ<td>クトンディキンソン</td><td>305122</td><td>日目:白血球RNA単離</td></tr><tr><td>シリンジ(5&nbsp;ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td>1日目および2日目:白血球RNA単離</td></tr><tr><td>変性溶解液&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>2日目:白血球RNA単離</td></tr><tr><td>5&nbsp;M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740011</td><td>2日目:白血球RNA単離</td></tr><tr><td>TRI試薬</td><td>Ambion</td><td>9738</td><td>2日目:白血球RNA単離</td></tr><tr><td>ブロモ-3-クロロプロパン(BCP)</td><td>Sigma</td><td>B-9673</td><td>2日目:白血球RNA単離</td></tr><tr><td>スピンカートリッジ&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>2日目:白血球RNA単離</td></tr><tr><td>0.1&nbsp;mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>2日目:白血球RNA単離</td></tr><tr><td>DNAフリーキット</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td><td>2日目:DNase treament</td></tr><tr><td>RNA 6000 Ladder&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1529</td><td>Day 2: バイオアナライザー分析</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Series II キット&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>2日目:バイオアナライザー分析</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>2日目:バイオアナライザー分析</td></tr><tr><td>エタノール>99%</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール >99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー超純水&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ (ヌクレアーゼフリー)</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter (serological)</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipetters (容量が1&nbsp;ml)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>ピペット(血清学的)</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>制御速度凍結容器</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>クライオボックス(2&nbsp;mlと5&nbsp;mlクライオバイアルと1.5&nbsp;ml微量遠心チューブ)</td><td>フィッシャー</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>試験管ラック</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp;mlポリプロピレンチューブ</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp;mlおよび0.65微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>07-200-534および07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp;mlと5&nbsp;mlクライオバイアル</td><td>フィ</td><td>ッシャー10-500-26および10-269-88F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&nbsp;ml CPTバキュテナー</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2チューブ</td></tr><tr><td>6&nbsp;ml K2 EDTAバキュテイナー</td><td>BD Biosciences</td><td>367863</td><td>2本入り</td></tr><tr><td>8.5&nbsp;ml SSTバキュテイナー</td><td>BD バイオサイエンス 367988</td><td></td><td>1チューブ</td></tr><tr><td>ボルテックサー</td><td>フィッシャー</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ用加熱ブロック付きドライバスインキュベーター</td><td>フィッシャー</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フード内で使用するためのろ過/真空システム</td><td>フィッシャー</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>エアロゾルタイト蓋付き微量遠心チューブ用固定角ローター</td><td>エッペンドルフ</td><td>22637002</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125用のスイングバケットローターとエアロゾルタイトキャップを備えた冷蔵遠心分離機。mmバキュテイナーと15&nbsp;mlポリプロピレンチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22628157</td><td>2、1つは冷蔵</td></tr>する必要はありません <tr><td>ナノドロップ2000(少量の精度に推奨)または他の分光光度装置</td><td>フィッシャー13-400-411</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アジレントバイオアナライザー</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>ズG2940CA</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素タンク</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>シャープスコンテナ</td><td>フィ</td><td>ッシャー22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>生物廃棄物容器</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223P52</td><td></td></tr>バイオ<tr><td>セーフティレベル2&nbsp;認定細胞培養フード</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

迅速な分別とコミュニティベースの設定から得られた試​​料中の全血液成分の単離

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

非臨床現場で収集し、全血サンプルの処理が持つと既存の条件なしの両方の地域在住の個人を評価するユニークな機会を提供しています。これらの試料の迅速な処理は、重要な細胞成分の分解を回避することが不可欠です。同時に末梢血単核細胞（PBMC）、DNAのための方法がここに含まれるものは、RNAおよび処理と首都圏全体での参加を同意の家で行われ、単一の採血から血清分離は、コレクションの2時間以内に開始しました。我々は、その後、成功したDNAのメチル化に使用されている一貫した、高品質の材料、遺伝子型決定、遺伝子発現をもたらす1,600血液検体を処理し、フローサイトメトリー分析を流れるようにこれらの技術を使用しています。採用される方法のいくつかは、標準的なものです。以下のように組み合わされたときしかし、それらは母集団および/または地域社会の参加者からのサンプルの効率的な処理を可能にします通常、臨床現場で評価されないベースの研究。したがって、このプロトコルは、一般集団のより代表的なものである（その後、データ）サンプルを得る可能性を秘めています。

これは、全体の手順は、遺伝子マイクロアレイ及びRT-PCR分析により発現、エピジェネティックな修飾の検出、および細胞サブセットの変化を含む下流のアプリケーションの多くにおいて、分析のための高品質材料を生産することが不可欠である。 表1は、材料の平均収量と品質を示しますプロセスのそれぞれから。 図3は、白血球 RNAの単離およびフィルタ処理方法の品質の出力の例を提供します。 図3の左上の画像は、キャピラリー電気泳動から得られたゲル画像です。各レーンは、劣化を示すことになる最小のシャドウイングを持つ2つの別個のバンドを生成する必要があります。ゲル以下のクロマトグラムは、ピークの位置と大きさに基づいて決定することができる劣化のレベルとタイプで追加の外観を提供します。 （;劣化した低）へのRNA完全性番号（RIN）が1の範囲で別の品質の尺度であります10（高;純粋な、良い品質のRNA）。 このようなハイスループット方法は、時折エラーに向いているが、品質管理を確保するための処理の様々な段階を...

私たちは、さらなる分析のために様々な成分を得るための全血の処理方法を概説します。私たちは、非臨床環境での全血サンプルの迅速でハイスループットな同時処理を可能にする合理化されたプロトコルを最適化しました。

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

この手順の全体的な目標は、迅速な眼のスループット、全血サンプルの同時処理を可能にする合理化されたプロトコルを提供することです。非臨床現場では、バキュテイナープロセッシングがオーバーラップ方式で行われ、D-N-A-R-N-A末梢血単核細胞またはpbmc血清の高品質な画分と血漿および赤血球の残留画分を効率的に分離することができます。処理は、血清バキュテナーの遠心分離、フィアルチューブのDNA単離遠心のための1つのフィアル含有バキュテナーからのアリコートの除去から始まります。その後、K2 EDTAバキュテナーからのDNA単離後のDNA単離の完了が起こり得る。各バキュテナーからの血液は、それぞれのフィルターを通過し、PBSで洗浄された後、RNA安定化剤で処理され、フィアル含有バキュテイナーに戻ります。残留プラズマを引き出し、単核層をPBSで洗浄します。チューブが回転している間に、残留した赤血球が収集され、分離された血清が分注されます。最後に、pbmcは細胞凍結培地に保存されます。最終的に、新鮮な血液の高品質な画分を採取から2時間以内に作製でき、すべてのアッセイ可能な検体を2日以内に入手することができます。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、この手法を非臨床環境で同時に実施できるため、マイクロアレイエピジェネティックなリアルタイムR-T-P-C-Rやフローサイトメトリー解析など、多数のダウンストリームアプリケーションのための出発物質を2日以内に作成できることです。手順を実演するのは、私の研究室のマネージャーであるエイミー・ウェックルです 全血サンプルの処理を開始します。バッファー、遠心分離機、ヒートブロックがすべて準備されていることを確認してください。バキュテイナーの配送時間をサンプル追跡シートに記録します。サンプルを受け取った後、血清単離を文書化します。検体ログの開始時間は、ブレーキと加速をオフにして7ミリリットルの血清バキュテナーを遠心分離することにより、すぐに処理を開始します。エアロゾルキャップ付きのスイングバケットローターを1300GSで摂氏4度で20分間使用し、血清バキュテイナーを遠心分離します。BSL 2細胞培養フードでのDNA単離開始時間を記録します。フィアルゲルを含む真空容器を5回反転させ、1つのバキュテナーの上部から200マイクロリットルの全血を2つの20マイクロリットルのプロテアーゼアリコートのそれぞれに加えます。.プロテアーゼと血液マイクロ遠心チューブをフードに残し、真空容器を含むコールの遠心分離に進みます。.遠心分離前。PBMC 分離の開始時刻を文書化し、採血から 2 時間以内である必要があります。エアロゾルタイトコンテナにすでに真空コンテナが含まれているFIコールを8〜10回反転させます。次に、バキュテナーを遠心分離し、ブレークして加速し、摂氏22度で1600Gで30分間オフにします。フード内のDNA分離サンプルに戻り、プロテアーゼおよび血液マイクロ遠心チューブのそれぞれに200マイクロリットルのバッファーalを追加します。チューブにキャップをして、ボンネットから取り外します。次に、それらを15秒間渦巻きにします。ボルテックスがすぐにフラッシュした後、サンプルを回転させます。添付のテキストプロトコルに記載されているように、DNAがEllucianのカラムから言及されるまでDNA単離を進めます。参加者ごとに 2 つのカラムから DNA をプールし、参加者あたり合計 800 マイクロリットルの収量を得ました。白血球RNA単離の開始時間を記録します。K two EDTAバキュテイナーのゴム製セプタムにトランスファースパイクを突き刺します。シースとスクリューキャップは、K two EDTAチューブシステムの組み立て後で使用するために保持してください。金属製のヘラの端を使用して針を安全に外し、空の10ミリリットルの真空採血チューブに針を挿入します。K 2 EDTAバキュテイナーフィルターレシーバーチューブアセンブリを反転させてセットアップを完了します ろ過とA PBS洗浄後、新しい10ミリリットルのシリンジを使用して3ミリリットルのRNA安定化剤を引き出します。フィルターをフラッシュし、RNA安定化剤が付着したままであることを確認します。次に、プランジャーを引っ込めずにシリンジをフィルターから取り外します。トランスファースパイクから保持されたシースとスクリューキャップでフィルターの入口と出口を密閉し、フィルターをRNA安定化剤で飽和させます。フィルターは、RAアイソレーションが完了するまで、摂氏マイナス80度で少なくとも2時間保管してください。バキュテナーをBSL 2フードに戻したら、ストッパーを取り外し、血清ピペットを使用して、単核層に近づくことなく上部血漿層の1.5ミリリットルを引き出します。2つのバキュテナーから血漿を5ミリリットルのクライオバイアルに移します。次に、収集したボリュームをログに記録します。血清学的ピペットを使用して、残りの血漿と単核層を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、事前に準備したXPBSを十分に追加して、円錐管の総容量を最大15ミリリットルにします。チューブにキャップをして、5回反転させます。次に、ブレークと加速をオフにしてチューブを遠心分離し、摂氏300GSで22°Cで15分間。フード内の真空容器を含むフィアルに戻り、赤血球または赤血球を採取します。5インチと3/4インチのパスティエピペットを使用して、フィアルゲル層の外側をぐるぐる回して緩め、取り除きます。血清学的ピペットを使用して、RBCを収集し、5ミリリットルのクライオバイアルに移します。次に、ボリュームをログに記録します。次に、血漿およびRBCクライオバイアルを制御速度凍結容器に移し、摂氏マイナス80度で少なくとも24時間保存します。24時間後、サンプルをクライオボックスに移し、マイナス80°Cに戻して長期保存します。遠心分離が完了したら、円錐形のチューブをフードに戻し、液体を吸引すると、ペレットを乱すことなく500マイクロリットルのPBSが残ります。XPBSを1つ追加して容量を10ミリリットルにし、ペレットを再懸濁します。チューブをそっとキャップし、5回反転させます。次に、ブレーキと加速でサンプルを遠心分離し、摂氏300GSで22°Cで10分間加速します。遠心分離後、バキュテナーから最上部の血清層を2ミリリットルのクライオバイアルに分注し、容量を文書化します。4つのクライオバイアルを使用し、200マイクロリットルをクライオバイアルに分注します。1000マイクロリットルをクライオバイアル2に。次に、残りの容量をクライオバイアル3と4に分割します。クライオバイアルをクライオボックスに移し、マイナス80°Cに保ち、長期保存します。そして、冷凍庫の開始時間を文書化します。PBMC 分離を続行します。遠心分離後にサンプルをフードに戻すときは、ペレットを乱さずにできるだけ多くの上清を吸引します。ペレットを2.5ミリリットルのPBMCに懸濁します。ミディアムワン。2.5ミリリットルのPBMCを加え、DMSOとRPMIを含む2つの培地を凍結します。事前に調製した細胞溶液に培地を移し、サンプルを穏やかにボルテックスします。次に、10マイクロリットルの細胞溶液をマイクロ遠心チューブに分注します。0.4%トリップパンブルーステイン10マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに加え、数回ピペッティングして溶液を混合します。次に、混合物の10マイクロリットルを細胞計数チャンバーにピペットで移します。スライドさせて、混合後3分以内にスライドをセルカウンターに入れます。ズームインして、セルに焦点を合わせます。次に、カウントセルを選択して、A-P-B-M-Cカウントを取得します。生存PBMC数が1ミリリットルあたり300万細胞を超える場合は、サンプルを最大5つのクライオバイアルに分注し、少なくとも1ミリリットルあたり300万細胞の濃度で分注します。それぞれが検体ログにクライオバイアルあたりの細胞数を記録します。生存PBMC数が1ミリリットルあたり300万細胞未満の場合の対処方法については、添付のテキストプロトコルを参照してください。最後に、クライオバイアルを制御速度の凍結容器に移し、摂氏マイナス80度で少なくとも24時間置きます。24時間後、クライオバイアルをクライオボックスに移し、ボックスを液体窒素タンクの気相に置いて長期保存します。フリーザーの開始時刻を試料ログに記録します。白血球RNA単離およびフィルター処理法により、キャピラリー電気泳動から得られたこのゲル像が得られました。ATTおよび28sリボソームRNAを表す2つの異なるバンドが最小限の分解で生成されました。この手順を試行する際には、正確なレコードを維持することが重要であることを覚えておくことが重要です。クライオバイアルのすべての情報(容量、濃度、品質、バーコード、保存場所など)を最初に保存するためのデータベースを開発することをお勧めします。また、サンプルの編成に関するその他の推奨事項は、テキストプロトコルに記載されています。

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