Генерация агрегатов эмбриональных стволовых клеток мыши, которые показывают нарушение симметрии, поляризация и возникающим коллективной Поведение In Vitro

Общая цель данного протокола заключается в получении однородных агрегатов эмбриональных стволовых клеток мыши, которые подвергаются самоорганизации и осевому удлинению и культивированию суспензии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как роль тканевых взаимодействий в спецификации доступа и самоорганизация в таких процессах, как газовые отношения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет изучать события развития с новой деконструктивной точки зрения за пределами эмбриона до агрегации.

Поддерживайте эмбриональные клетки мыши или М-МК в ЭС. Подъемная среда на желатиновом покрытии площадью 25 квадратных сантиметров обработана культурой тканей колб для получения заполнителя. Начните с колбы для культуры тканей, содержащей клетки при температуре от 40 до 60%. Слияние аспираторов и дважды промойте колбу. При PBS добавьте один миллилитр точки 25% трипсина ЭДТА и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно пяти минут, чтобы отделить клетки от колбы.

Далее добавьте пять миллилитров среды Es.Lift в отделенную клеточную суспензию и тщательно перемешайте. Переложите клетки в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и выньте аликвоту объемом один миллилитр, чтобы подсчитать клетки. Добавьте пять раз по 10 до четвертой клетки к пяти миллилитрам теплого PBS и центрифугируйте клетки при 170 умноженных на G в течение пяти минут.

Аспирируйте раствор, не нарушая гранулы. Затем аккуратно добавьте пять миллилитров PBS и повторите центрифугирование. Отсасывайте максимальный объем, не нарушая клеточную гранулу.

Для предотвращения переноса PBS. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре теплой N двух B 27 среды. Хорошо перемешайте с помощью пипетки P 1000 для получения однородной клеточной суспензии.

Затем разбавьте его дополнительно четырьмя миллилитрами N двух В 27 среды. Перенесите клеточную суспензию в стерильный резервуар с помощью многоканальной пипетки. Тщательно перемешайте клетки и перенесите 40 микролитров клеточной суспензии из резервуара в каждую лунку в нетканевую культуру, обработанную убо.

Пластина на 96 лунок. Планшет без культуры тканей специально используется для минимизации адгезии клеток к планшету. Инкубируйте планшет во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48 часов, чтобы обеспечить агрегацию клеток через 48 часов.

Достаньте планшет из инкубатора и понаблюдайте за клетками под перевернутым микроскопом и подтвердите наличие агрегатов. Добавьте объем 10 миллимоляров CHI 9 9 0 2 1 стоковый раствор к теплому N два B 27, чтобы получить концентрацию трех микромоляров. Это вторичная среда для стимуляции клеток.

С помощью многоканальной пипетки дозируют по 150 микролитров вторичной среды в каждую лунку. С достаточной силой, чтобы выбить любые прилипшие агрегаты. Верните планшет в инкубатор для клеточных культур в течение 24 часов после инкубации.

Осторожно удалите среду, не отсасывая клеточный агрегат. Добавьте по 150 микролитров заново N два B 27 в каждую лунку с силой, достаточной для вытеснения любых прилипших агрегатов. Повторяйте это каждые 24 часа, чтобы общая продолжительность инкубации составила примерно пять дней.

Чтобы подготовить агрегаты к фиксации, сначала аккуратно отсасывайте инкубационный раствор из каждой лунки, держа пипетку под углом 30 градусов. Чтобы предотвратить аспирацию клеточного агрегата, добавьте в каждую по 150 микролитров PBS. Ну и подождите несколько минут, чтобы агрегат осядет на дне, а затем аспирируйте PBS.

Повторите этот шаг умывания еще дважды с помощью стерильных ножниц. Разрежьте наконечник пипетки P 1000 примерно на три миллиметра выше дозатора. Закончите с этим наконечником, проведите пипетку вверх и выпустите небольшой объем жидкости в лунку.

Взболтать агрегат и разрыхлить его со дна лунки. Затем натяните агрегат на кончик и перенесите агрегат в стеклянную диссекцию дрозофилы. Ну и с помощью той же процедуры соберите все агрегаты, которые будут подвергаться идентичным процедурам иммуноокрашивания, в единое рассечение.

Хорошо поместите углубление для рассечения под микроскоп и покрутите его, чтобы переместить агрегаты к центру. Затем осторожно отсасывайте ППС от края лунки. Следите за тем, чтобы не удалить какие-либо агрегаты.

Для фиксации агрегатов добавьте один миллилитр свежеприготовленного 4%-ного раствора формальдегида и выдержите посуду в орбитальном шейкере в течение двух часов при температуре четыре градуса Цельсия. Устанавливается на низкую скорость. Отсадите раствор формальдегида с осторожностью, чтобы не допустить всасывания каких-либо агрегатов, а затем добавьте один миллилитр PBS в лунку.

Верните пластину в орбитальный шейкер на 10 минут. Извлеките PBS из колодца и повторите этот этап промывки еще два раза. Далее добавьте один миллилитр раствора P-B-S-F-T и поместите пластину на орбитальный шейкер на 10 минут.

Отсадите раствор и повторите промывку еще два раза. Добавьте один миллилитр P-B-S-F-T в лунку, чтобы блокировать агрегаты от неспецифической иммунореактивности. Поместите пластину на орбитальный шейкер на низкой скорости на один час при температуре четыре градуса Цельсия.

После инкубации осторожно отасуньте блокирующий раствор из лунок и добавьте 500 микролитров первичного антитела, разведенного в P-B-S-F-T. Запечатайте планшет параформом, чтобы предотвратить испарение, и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия на орбитальном вибростенде на низкой скорости. Затем замените первичный раствор антитела на предварительно охлажденный P-B-S-F-T.

Промойте заполнители, поместив пластину на орбитальный встряхиватель. Установите на низкую скорость при четырех градусах Цельсия на пять минут. Повторите стирку еще раз.

Выполните два дополнительных цикла стирки с помощью P-B-S-F-T при температуре четыре градуса Цельсия на низкой скорости на орбитальном встряхивателе. Как указано в текстовом протоколе, удалить промывочный раствор и инкубировать с 500 микролитрами вторичного антитела, разведенного в P-B-S-F-T. Добавьте один микрограмм на миллилитр герста, чтобы визуализировать ядра, инкубируемые в течение ночи при четырех градусах Цельсия на защищенном от света гираторном роторе.

Выполните еще один цикл стирки с PBS FT при четырех градусах Цельсия, защищенном от света под коробкой, завернутой в фольгу. Выполните дополнительные промывки с PBS, содержащим 0,2% FBS и 0,2% Triton X 100, или буфером PBT при комнатной температуре. После тщательной аспирации раствора инкубируйте агрегаты с одним миллилитром глицерина один к одному до ПБТ в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре.

Затем инкубируйте их с одним миллилитром семи-трех глицеринов до ПБТ в течение 30 минут. Для подготовки образцов к конфокальной визуализации необходимо аспирировать глицерин до раствора ПБТ и заменить его одним миллилитром монтажной среды. Затем смонтируйте агрегаты в каплях по 17 микролитров на предметное стекло.

С помощью наконечника для пипетки подготовьте распорку, сложив кусок двустороннего скотча в четыре раза на себя. Затем поместите по одной распорке с каждой стороны от агрегатов на предметном стекле, переверните крышку, наденьте распорки, а затем визуализируйте агрегаты с помощью конфокальной микроскопии. Через 48 часов после нанесения покрытия формируются заполнители диаметром около 150 микрометров с гладкими границами.

120 часов непрерывного лечения CHI 9 9 0 2 1 ингибитором гликогенсинтазыкиназы 3 приводит к удлинению сферического агрегата. 120 часов непрерывного лечения ингибитором CHI 9 9 0 2 1 гликогенсинтазыкиназы три приводит к удлинению сферического агрегата. Кроме того, существует отчетливая локализация SOX GFP-положительных клеток на одном конце агрегата после лечения, различные методы лечения приводят к различным изменениям морфологии одного агрегата и флуоресцентного маркера.

Локализацию в агрегате можно отследить с течением времени. После освоения исследователь сможет генерировать агрегаты в течение примерно 45 минут, если он выполнен правильно. После того, как агрегаты сформированы, вместо иммуноокрашивания можно использовать другие методы, такие как Q-R-T-P-C-R, для исследования изменений в экспрессии генов в агрегатах.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как формировать агрегаты из МЭК, применять специфические стимулы и готовить агрегаты к иммуноокрашиванию и анализу конфокальной микроскопии.