Intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren

Dit protocol beschrijft de techniek om muismodellen te genereren met primair osteosarcoom en de pulmonale metastaselaesies. Door intratibiale injectie van osteosarcoomcellen bootst dit model het beste de klinische ontwikkelingskenmerken van tumorostepinoom na. Nauwkeurige aantallen osteosarcoomcellen worden rechtstreeks in het scheenbeen geïnjecteerd met behulp van een microvolumespuit, waardoor identieke tumorvormingssnelheden en tumorvolumes mogelijk zijn.

Op de dag van osteosarcoomcelinjectie, was de cellen twee keer met PBS. Trypsinize de cellen met 1,5 milliliter van 0,25% trypsine gedurende drie minuten. Voeg vervolgens zes milliliter 10% serumbevattende MEM-media toe.

Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 15 milliliter. Zuig 20 microliter celsuspensie op in de kamer van de celtelplaat en bereken de celconcentratie met behulp van een automatische celteller. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 800 maal g.

Adem het supernatant op met een pipet, resuspend de celkorrel in een keldermembraanmatrix van 8,5 milligram per milliliter en plaats ze op ijs. Plaats de muis in rugligging. Houd de enkel van de muis vast met de duim en wijsvinger en desinfecteer de injectieplaats van het scheenbeen met een 70% ethanol wattenstaafje.

Draai het enkelgewricht van elke muis naar buiten om het scheenbeen en kuitbeen te bewegen en buig het kniegewricht naar een geschikte positie totdat het proximale tibiaplateau zichtbaar is door de huid. Bevestig de naald aan een spuit van één milliliter en richt de punt van de naald in de richting van de injectieplaats, evenwijdig aan de as van het scheenbeen. Breng de naald percutaan in om een gat door het tibiaplatform naar het distale uiteinde van het scheenbeen te boren.

Laad de osteosarcoomcelsuspensie die eerder op ijs is geplaatst in een microvolumespuit en vervang de spuit van één milliliter in het scheenbeen door de met osteosarcoomcellen geladen microvolumespuit. Injecteer langzaam ongeveer 10 microliter osteosarcoomcelsuspensie in het scheenbeen van elke athymische muis zonder veel druk uit te oefenen. Verwijder vervolgens de microvolumespuit van de injectieplaats en druk ongeveer 30 seconden met het wattenstaafje op de plaats.

Plaats de muis terug in een schone kooi en observeer het herstel gedurende 10 minuten. Deze figuur toont het muismodel met orthotopisch osteosarcoom ontwikkeld uit intratibiale osteosarcoomcelinjectie en de geïsoleerde vorm ervan. Een geleidelijke toename van het tumorvolume wordt elke week waargenomen.

De röntgenfoto's verkregen van de eerste tot en met de zesde week na injectie van luciferase-gelabelde osteosarcoomcellen toonden een geleidelijke toename van het volume. Bovendien toonde het beeld verkregen na de injectie in het scheenbeen van de muis orthotopische osteosarcoomgroei in vivo. De pulmonale metastase veroorzaakt door intratibiale injectie van de osteosarcoomcellen werd met succes in vivo gevolgd met behulp van een bioluminescentie live imaging-systeem.

Observatie onder een stereomicroscoop onthulde gemetastaseerde kolonies in de geïsoleerde longweefsels. He-kleuring op paraffine-ingebedde longweefsels toonde gemetastaseerde laesies. De naald moet percutaan via het patellape ligament in het gewrichtskapsel worden ingebracht om een gat door het tibiaplatform naar het digitale scheenbeen te boren door de spuit te draaien.