Name: Importance of Single Cell Sorting in Isolating Purified Populations of Mesenchymal Stem Cells (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-11-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Importance of Single Cell Sorting in Isolating Purified Populations of Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

نشكر مرفق خلايا التدفق في مركز جواهر لال نهرو للبحوث العلمية المتقدمة ، بنغالورو ، الهند ، على استخدام المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي. تم إجراء التقسيم بالتبريد لثقافة الحبيبات للخلايا المتمايزة في مختبر نيوبيرج أناند المرجعي ، بنغالورو ، الهند. تم دعم هذا العمل من خلال التمويل الداخلي لجامعة كاليفورنيا من أكاديمية مانيبال للتعليم العالي (MAHE) ، الهند. AG ممتنة لدعم منحة الدكتور T. M. A. PAI من MAHE.

الموافقة الأخلاقية والموافقة على المشاركة: تم استلام عينات لب الأسنان المتساقطة المقشرة البشرية بعد الحصول على الموافقة المستنيرة والموافقة الأخلاقية الكاملة من قبل كلية ومستشفى سري راجيف غاندي لطب الأسنان (SRGCDS) قسم الفم والوجه والفكين ، بنغالورو ، وفقا للمعايير التي وضعتها لجنة التخلي...

Fluorescence-Activated Single-Cell Sorting of Human Mesenchymal Stem Cells

<ol>
	<li>Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+Identification,+phenotypic+characterization,+biological+properties+and+potential+for+regenerative+medicine+through+biomaterial+micro-engineering+of+their+niche.">Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche.</a> Methods. 99, 62-68 (2016).</li><li>Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplicity+of+mesenchymal+stromal+cells:+finding+the+right+route+to+therapy.">Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+biological+characteristics+of+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+exfoliated+deciduous+teeth,+bone+marrow,+gingival+tissue,+and+umbilical+cord.">Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).</li><li>McLeod, C. M., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+and+impact+of+mesenchymal+stem+cell+heterogeneity:+new+insights+and+emerging+tools+for+single+cell+analysis.">On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis.</a> European Cells &amp; Materials. 34, 217-231 (2017).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells-how+the+disease+process+impacts+clinical+considerations.">Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations.</a> Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).</li><li>Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow,+umbilical+cord+blood,+or+adipose+tissue.">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).</li><li>Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+address+mesenchymal+stem/stromal+cell+heterogeneity+in+immunomodulatory+profiles+to+improve+cell-based+therapies.">Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies.</a> Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).</li><li>Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+phenotype+and+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+aging+in+vitro.">Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 131 (2018).</li><li>Costa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+from+natural+niches+to+culture+conditions:+implications+for+further+clinical+uses.">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).</li><li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+activated+cell+sorting.">Fluorescence activated cell sorting.</a> Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).</li><li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations.">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li><li>Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+for+purification+of+plasmacytoid+dendritic+cells+from+the+mouse+bone+marrow.">Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li><li>Roda, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+stem+cell+tag-less+sorting+method.">A novel stem cell tag-less sorting method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).</li><li>Hall, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+small+CD44-negative+mesenchymal+stem/progenitor+cells+from+human+bone+marrow+using+elutriation+and+polychromatic+flow+cytometry.">Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).</li><li>Eggleton, M. J., Sharp, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+counting+using+the+Coulter+electronic+counter.">Platelet counting using the Coulter electronic counter.</a> Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).</li><li>Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leu+7++(HNK-1+)+cells.+II.+Characterization+of+blood+Leu+7++cells+with+respect+to+immunophenotype+and+cell+density.">Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).</li><li>Hewitt, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells.">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).</li><li>Singh, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+protocol+for+single-cell+cloning+human+pluripotent+stem+cells.">An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).</li><li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+functional+and+gene+expression+analysis+resolves+heterogeneity+within+stem+cell+populations.">Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li><li>Zhou, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+mesenchymal+stem/progenitor+cells:+the+immunomodulatory+masters.">Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters.</a> Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).</li><li>Fawzy El-Sayed, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mesenchymal+stem+cells+explored+in+the+dental+field.">Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).</li><li>Hardy, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+networks+in+single+perivascular+cells+sorted+from+human+adipose+tissue+reveal+a+hierarchy+of+mesenchymal+stem+cells.">Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FACSAria Fusion User's Guide. , (2018).</li></ol>

في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، من بين مصادر ما بعد الولادة ، جذبت MSCs المشتقة من الأنسجة الفموية اهتماما عميقا بسبب الحد الأدنى من التزاماتها الأخلاقية وإمكانية التمايز الملحوظة متعددة السلالات21. حازت الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من الضرس الثالث المتأثر و SHEDs على أ?...

يمكن اعتبار الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا المناسبة للعلاجات القائمة على الخلايا ويمكن اعتبارها نظاما قياسيا ذهبيا في الطب التجديدي. يمكن عزل هذه الخلايا من مجموعة متنوعة من المصادر في الجسم بأصول أنسجة مختلفة1. اعتمادا على أنسجة المصدر ، يعرض كل نوع من أنواع MSC سلوكا غامضا في المختبر 2. ويلاحظ هذا بشكل جيد في خصائصها المورفولوجية والوظيفية3. أظهرت دراسات متعددة تباينا داخل النسيل في الأبعاد ، بما في ذلك تمايز الأنسجة البالغة ، والحالة الجينومية ، والبنية الأيضية والخلوية ل MSCs 2,4.
كان التنميط المناعي للخلايا تطبيقا شائعا لقياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا الجذعية ، وقد تم استخدام ذلك من قبل الجمعية الدولية للعلاج بالخلايا والجينات (ISCT) في عام 2006 لوصف قائمة بالمعايير الدنيا لتحديد الخلايا على أنها MSCs. وذكر أنه إلى جانب الالتصاق البلاستيك والقدرة على التمايز إلى ثلاث سلالات (عظمية المنشأ ، غضروفية ، ودهنية) في المختبر ، يجب أن يعبر ≥95٪ من سكان الخلايا عن CD105 و CD73 و CD90 ، ويجب أن تفتقر هذه الخلايا إلى التعبير (≤2٪ إيجابي) ل CD34 و CD45 و CD11b و CD14 و HLA-DR ، كما تم قياسها بواسطة قياس التدفقالخلوي 5. على الرغم من أن MSCs تم تعريفها بواسطة مجموعة من المؤشرات الحيوية بموجب الحد الأدنى من معايير ISCT ، إلا أنه لا يمكن قياس خصائصها المناعية باستخدام هذه المؤشرات الحيوية وكانت هناك حاجة إلى المزيد من هذه المعايير لجعل المقارنات عبر الدراسة والاختلافات النسيلية أسهل في القياس الكمي2.
على الرغم من المبادئ التوجيهية التي وضعتها ISCT ، فقد أظهرت الأبحاث المكثفة حول MSCs أن عدم التجانس موجود في هذه الفئة من السكان ، والذي يمكن أن ينشأ بسبب العديد من العوامل ، ويرجع ذلك أساسا إلى الطبيعة المنتشرة في كل مكان لعدم التجانس الذي ينشأ بين الجهات المانحة MSC6 ، ومصادر الأنسجة7 ، والخلايا الفردية داخل السكان النسيلي8 ، وظروف الثقافة 2,9 ، 10. يعد توصيف وتنقية هذه الخلايا الأولية من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة لضمان الجودة ومصير الخلايا خطوات أساسية في إنتاجها. تتطلب الحاجة إلى فهم الاختلافات المعروضة بين السكان طريقة فعالة لحلها إلى مجموعات فرعية يمكن تقسيمها وجمعها بشكل منفصل11. تساعد تحليلات مستوى الخلية الواحدة في التغلب على تحديات الاختلاف بين الخلية والخلية ، وتقليل الضوضاء البيولوجية الناشئة عن مجموعة غير متجانسة ، وتوفر القدرة على التحقيق في الخلايا النادرة وتوصيفها12.
بناء على الغرض والمعلمات المختارة ، يمكن استخدام عدة طرق لفرز وإثراء المجموعات السكانية المختارة. يمكن أن تشتمل تقنيات فرز الخلايا على طرق فرز بالجملة وفرز خلية واحدة. في حين أن الفرز بالجملة يمكن أن يثري السكان المستهدفين من خلال فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) 13 ، والتجزئة 14 ، والتطهير 15 ، فإن الفرز أحادي الخلية يمكن أن يثري مجموعات أكثر تجانسا عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) 11. ويسلط الجدول 1 الضوء على التحليلات المقارنة لكل طريقة من هذه الطرق مع مجموعة المزايا والعيوب الخاصة بها.
الجدول 1: تحليلات مقارنة للتقنيات المختلفة: MACS ، والتجزئة ، والتطهير ، و FACS مع إبراز الاختلافات في مبدأها ومزايا وعيوب اختيار تقنية معينة على أخرى. الاختصارات: MACS = فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا ؛ FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65723/65723_Table_1_.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
منذ ظهور هذه التقنية ، لعب قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية دورا رئيسيا في التعداد16 ، والكشف ، وتوصيف مجموعة خلايا معينة في عينة غير متجانسة17. وضع هيويت وآخرون في عام 2006 الأساس لمنهجية فرز الخلايا الآلية لتعزيز عزل المجمعات المتجانسة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتمايزة (hESCs)18. أدى الفرز أحادي الخلية إلى إثراء مجموعة hESCs المحولة بواسطة GFP مما يسهل عزل المستنسخة المعدلة وراثيا ، مما فتح بعدا جديدا في البحث السريري. لتحسين كفاءة الفرز ، تم اتباع نهجين بشكل عام ؛ إما أن يتم تعديل وسائط جمع المجموعات السكانية التي تم فرزها للحفاظ على صلاحية وتكاثر الخلايا بعد الفرز19 أو يتم تعديل خوارزمية / برنامج فرز الخلايا بشكل مناسب12.
مع تقدم التكنولوجيا ، تمكنت أجهزة قياس التدفق الخلوي التجارية وأجهزة فرز الخلايا من المساعدة في مواجهة التحديات التي تمت مواجهتها أثناء فرز مجموعات الخلايا الهشة والنادرة بشكل معقم ، وخاصة الخلايا الجذعية من أصول مختلفة. كان أحد التحديات الرئيسية لعلماء بيولوجيا الخلايا الجذعية هو العزلة النسيلية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باتباع بروتوكولات النقل المطلوبة في دراسات تحرير الجينات19. تمت معالجة ذلك عن طريق فرز الخلايا المفردة إلى 96 لوحة جيدة تم تغليفها بالخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) جنبا إلى جنب مع المكملات الغذائية ومثبطات ROCK التجارية الصغيرة. ومع ذلك ، يمكن تحسين استراتيجيات عزل الخلايا إلى حد كبير باستخدام فرز المؤشر ، وهي سمة من سمات خوارزمية الفرز التي تحدد النمط المناعي للخلايا الفردية التي تم فرزها12. ساعدت هذه الطريقة المكررة في فرز الخلية الواحدة ليس فقط في تعزيز كفاءة الفرز للخلايا الجذعية ، خاصة فيما يتعلق بمجموعات الخلايا الجذعية المكونة للدم النادرة ، ولكن أيضا ربط المستنسخة أحادية الخلية بكفاءة بمقايساتها الوظيفيةالنهائية 20.
تركز هذه الورقة على فرز الخلايا الجذعية أحادية الخلية للخلايا الجذعية المناعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية (SHEDs) لإثراء المجموعات الفرعية لدراسة قدراتها على التمايز الوظيفي. باستخدام مزيج من علامتين إيجابيتين ل MSC ، CD90 و CD73 ، وعلامة مكونة للدم سلبية CD45 ، تم تحديد MSCs ذات النمط المناعي وتم تحديد التعبيرات الخافتة والصفرية. بناء على النمط المناعي الخاص بهم ، تم تحديد المجموعات السكانية الفرعية على أنها MSCs نقية ، مجموعات إيجابية واحدة وسلبية مزدوجة. تم فرزها باستخدام وضع الفرز أحادي الخلية للحصول على مجموعات فرعية نقية وغنية لمزيد من الدراسات الوظيفية لتحديد ما إذا كان التعبير التفاضلي للعلامات هو قطعة أثرية لظروف الاستزراع في المختبر أو ما إذا كان له أي تأثير على الخصائص الوظيفية أيضا. تم فرز الخلايا التي لم تكن معبرات متجانسة من "علامات MSC الإيجابية" لدراسة خصائصها الوظيفية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alcian Blue Stain</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>CCK029-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 &#181;m) Particles Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Accudrop Beads&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>345249</td>
			<td>Used to set up the Laser delay when the sort module opens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria Fusion Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Diva 9.4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td>Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Horizon V450 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560374</td>
			<td>CD44-V450 isotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>CD105-APC isotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen DAPI Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564907</td>
			<td>DAPI Stock solution of 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td>CD90-FITC isotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>CD45-PE isotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550795</td>
			<td>CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Hi-Media&#160;</td>
			<td>TC548-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Nice chemical pvt ltd&#160;</td>
			<td>C33809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>D5652-50L</td>
			<td>dPBS used for culture work and maintenance.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
			<td>Used for general sterlization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher&#160;</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KO-DMEM</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher&#160;</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM (100x)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, for Molecular Biology&#160;</td>
			<td>Hi-Media&#160;</td>
			<td>MB113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O</td>
			<td>HiMedia&#160;</td>
			<td>CCK013-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>loba chemie</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher&#160;</td>
			<td>15140- 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>R37110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Nitrate</td>
			<td>HiMedia&#160;</td>
			<td>MB156-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Thiosulphate pentahydrate</td>
			<td>Chemport</td>
			<td>10102-17-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 &#181;m</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer&#160;</td>
			<td>Prepared in MIRM&#160;</td>
			<td>----</td>
			<td>It was prepared using 2% FBS in PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media&#160;</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A10410-01</td>
			<td>Basal media for Adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Supplement</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A10065-01</td>
			<td>Induction media for Adipogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Supplement</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A10064-01</td>
			<td>Induction media for Chondrogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Supplement</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A10066-01</td>
			<td>Induction media for Osteoogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media&#160;</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A10069-01</td>
			<td>Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Hi-Media&#160;</td>
			<td>MB031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Gibco by life technologies&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA Solution 1x</td>
			<td>Hi-media&#160;</td>
			<td>TCL049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>MERCK&#160;</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell sorting of immunophenotyped mesenchymal stem cells from human exfoliated deciduous teeth

تمتلك الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) للكائن الحي قدرة غير عادية على التمايز إلى سلالات متعددة من الخلايا البالغة في الجسم وهي معروفة بخصائصها المناعية والمضادة للالتهابات. يعد استخدام هذه الخلايا الجذعية نعمة لمجال البيولوجيا التجديدية ، ولكنه في الوقت نفسه لعنة على الطب التجديدي والعلاجات بسبب الغموض الخلوي المتعدد المرتبط بها. قد ينشأ هذا الغموض من التنوع في مصدر هذه الخلايا الجذعية ومن ظروف نموها في المختبر ، وكلاهما ينعكس على عدم تجانسها الوظيفي.
وهذا يستدعي منهجيات لتوفير مجموعات نقية ومتجانسة من MSCs للتطبيقات العلاجية. مكن التقدم في مجال قياس التدفق الخلوي من اكتشاف مجموعات الخلية المفردة باستخدام نهج متعدد المعلمات. يحدد هذا البروتوكول طريقة لتحديد وتنقية الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية (SHEDs) من خلال فرز الخلية المفردة بمساعدة الفلورة. حدد التعبير المتزامن للعلامات السطحية ، وهي CD90-fluorescein isothiocyanate (FITC) ، CD73-peridinin-chlorophyll-protein (PerCP-Cy5.5) ، CD105-allophycocyanin (APC) ، و CD44-V450 ، التعبيرات الإيجابية "الساطعة" ل MSCs باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات. ومع ذلك ، لوحظ انخفاض كبير في النسب المئوية للتعبيرات الرباعية لهذه العلامات الموجبة من المقطع 7 فصاعدا إلى المقاطع اللاحقة.
تم فرز المجموعات السكانية الفرعية ذات النمط المناعي باستخدام وضع الفرز أحادي الخلية حيث شكلت علامتان موجبتان وعلامة سلبية واحدة فقط معايير التضمين. ضمنت هذه المنهجية صلاحية الخلية للسكان الذين تم فرزهم وحافظت على تكاثر الخلايا بعد الفرز. يمكن استخدام تطبيق المصب لمثل هذا الفرز لتقييم التمايز الخاص بالنسب للمجموعات السكانية الفرعية المسورة. يمكن تطبيق هذا النهج على أنظمة الخلية المفردة الأخرى لتحسين ظروف العزل والحصول على معلومات علامات سطح الخلية المتعددة.

Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth

تميزت SHEDs بمقايسات التألق المناعي القياسية التي تظهر التعبير عن vimentin (خيوط وسيطة من النوع الثالث) ، وخيوط الأكتين (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) ، والنوى الملطخة ب DAPI (الشكل 1 أ). لتقدير قدراتها التكاثرية وتشكيل المستعمرات ، تم إجراء فحوصات نمو الخلايا القياسية على المدى القصير. وقد تب?...

Watch this Scientific Journal Video about Importance of Single Cell Sorting in Isolating Purified Populations of Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Importance of Single Cell Sorting in Isolating Purified Populations of Mesenchymal Stem Cells (Video) | JoVE

يصف هذا البروتوكول استخدام فرز الخلايا المنشطة بالتألق للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية باستخدام طريقة فرز الخلية الواحدة. على وجه التحديد ، يمكن أن يحقق استخدام الفرز أحادي الخلية نقاء 99٪ من الخلايا المناعية من مجموعة غير متجانسة عند دمجها مع نهج قائم على قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات.

فرز الخلية الواحدة للخلايا الجذعية الوسيطة المناعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and ...

يفصل هذا البروتوكول طريقة حاسمة لتوصيف وتنقية الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية بدقة على منصة واحدة ، مما يتيح تطبيقات فعالة في المراحل النهائية مثل زرع الخلايا الجذعية. إنه مهم بشكل خاص للمختبرات السريرية التي تعزز المقايسات الجزيئية والخلوية الوراثية من خلال الفرز الدقيق للخلية المفردة للخلايا الجذعية المهندسة أو الطبيعية. تشير الطرق الشائعة الاستخدام لعزل مجموعات الخلايا الجذعية النقية إلى تقنيات مثل الفصل المغناطيسي المناعي أو تدرج الكثافة أو فرز خلايا الموائع الدقيقة.تسمح تقنية مثل فرز الفهرس بربطها بتوصيف الحمض النووي الريبي أحادي الخلية الذي يمكنه استخراج معلومات النسخ لكل خلية تم فرزها. تتضمن التحديات الرئيسية الحفاظ على جودة العينة ، وتحسين ظروف زراعة الخلايا ، بما في ذلك كثافة الخلية وصلاحيتها أثناء وبعد الفرز. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم أيضا النظر في اختيار أحجام فوهات مناسبة للأداة وضمان الوصول في الوقت المناسب إلى آلات الفرز.يوضح هذا البروتوكول لوحة تلطيخ دقيقة للتنميط المناعي وفرز عدد الخلايا المطلوب. إنه يضمن جودة العينة الموحدة ، والجدوى المثلى للخلية ، وكثافة فرز عدد الخلايا وتحديد المعلمات التجريبية للفرز على برنامج FACSDiva. تتيح هذه الطريقة الاختيار المباشر والتنميط المناعي لسكان الخلايا الجذعية الذين يعبرون عن مؤشرات حيوية محددة.تسمح هذه المنصة البسيطة بالفرز الفعال بناء على السكان المستهدفين الذين يساعدون في الحصول على عينات منقاة للتطبيقات اللاحقة.