Tradicionalmente, el corte vertical y la preparación de todo el montaje de la retina se han utilizado para estudiar la función de los circuitos de la retina. Aquí se describe la novela de corte método para preservar la morfología dendrítica de neuronas intactas retina.
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Artículo de método
Preparación de corte horizontal de la retina
En este artículo
Resumen
Resumen
Tradicionalmente, el corte vertical y la preparación de todo el montaje de la retina se han utilizado para estudiar la función de los circuitos de la retina. Sin embargo, muchas de las neuronas de la retina, como las células amacrinas, ampliar sus dendritas horizontalmente, por lo que la morfología de las células se supone que es severamente dañada en los cortes verticales. En la preparación de todo el montaje, sobre todo para las grabaciones de patch-clamp, las neuronas de la retina en la capa del medio no son de fácil acceso debido a la extensa cobertura de las células gliales (células Mueller) endfeets s. Aquí se describe la novela de corte método para preservar la morfología dendrítica de neuronas intactas retina. El corte se hace horizontalmente en la capa interna de la retina, utilizando una máquina de cortar vibratome después de la retina se ha incrustado en la baja temperatura de fusión en gel de agarosa. En esta preparación corte horizontal de la retina, se estudió la función de neuronas de la retina en comparación con su morfología, mediante el uso de patch-clamp grabación, la técnica de imágenes de calcio, inmunocitoquímica, y una sola célula de RT-PCR.
Protocolo
- Prepare un bloque de agar (30 mg / ml, es decir, un 3%, en agua destilada). Disolver y microondas por primera vez y se vierte en un recipiente de vidrio. Mantenga el recipiente en el refrigerador a 4 º C.
Consejo: El bloque de agar deben estar preparados de antemano.
- Preparar a baja temperatura de fusión en gel de agarosa (25 mg / ml, es decir, un 2,5%, en media). Disolver y microondas. Mantenerlo en el baño de agua caliente a 35 º C.
Sugerencia: Mantenga el gel de agarosa no demasiado caliente. Si hace demasiado calor, se necesita mucho tiempo para ser solidificada, y el gel se puede matar a la retina
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Discusión
Hay varias ventajas importantes de la preparación de corte horizontal de la retina.
En primer lugar, la morfología de las células que se expanden horizontalmente dendritas, como las células amacrinas y células horizontales, se conserva. Se ha demostrado que hay más de 20 tipos de células amacrinas de la retina (MacNeil y Masland, 1998), por lo que es muy importante comparar la morfología de las células con las propiedades fisiológicas.
En segundo lugar, en la retina de todo el montaje, la extensa cobertura de las células gli.......
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Divulgaciones
Todos los protocolos experimentales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de animales.
Agradecimientos
Agradecemos a los Dres. Richard H. Masland y Kaneko Akimichi por darnos consejos y sugerencias para establecer el procedimiento de la preparación de corte horizontal de la retina.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarosa L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Agarosa de fusión a baja temperatura |
| Hialuronidasa | Sigma-Aldrich | Tipo I-S, 300 U/mg | |
| Medio | en mM: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl2, 1,0 MgCl2, 23 NaHCO3 y 10 glucosa, mantenido a pH 7,8, o Solución Ames’ (Sigma) | ||
| Micróondas | |||
| Baño de agua caliente | 35 °C | ||
| Cortador vibrátomo | Leica Microsystems | VT1000S | |
| Filtros de membrana MF | EMD Millipore | HAWP01300 | Papel filtro, tamaño de poro 0,45 µm |
| Herramientas de disección | pinzas, cuchilla, pinza, pinzas de presión, etc. | ||
| Pegamento instantáneo | por ejemplo Alonalpha, Krazy Glu | ||
| Jeringa de 50 mL | |||
| Filtro para jeringa | EMD Millipore | SX0001300 |
Referencias
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H.
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Reimpresiones y permisos
