Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Descrição de um processo de fosforilação quantitativa usando cryolysis, solubilziation uréia, fracionamento e enriquecimento HILIC IMAC de peptídeos fosforilados.
Abstract
Este protocolo descreve o crescimento e estímulo, com o oleato de ácidos graxos, de células de Saccharomyces isotopicamente leves e pesados S.. Células são solo usando um procedimento cryolysis em um moedor de moinho de bolas e os grindate resultando colocada em solução de solubilização da uréia. Este procedimento permite a lise das células em um estado metabolicamente inativas, preservando fosforilação e evitando reorientação da phosphoproteome durante a lise celular. Após a redução, alquilação, digestão com tripsina das proteínas, as amostras são dessalinizada em colunas C18 e da complexidade amostra reduzida por fracionamento através de cromatografia de interação hidrofílica (HILIC). Colunas HILIC preferencialmente reter moléculas hidrofílicas que é bem adequado para phosphoproteomics. Peptídeos fosforilados tendem a eluir mais tarde no perfil cromatográfico do que as contrapartes não fosforilado. Após o fracionamento, fosfopeptídeos são enriquecidos por cromatografia em fase de metal imobilizado, que conta com carga baseada em afinidades de enriquecimento fosfopeptídeos. No final deste procedimento as amostras estão prontas para serem analisadas quantitativamente por espectrometria de massa.
Protocol
Discussion
Este método irá produzir um enriquecimento da fosfopeptídeos que podem ser analisadas quantitativamente. Um número de parâmetros podem ser alterados neste protocolo, mas o aspecto mais importante a lembrar é o de preservar a sua fosforilação. Preparação de células para a quantificação pode ser alcançado em um número de diferentes maneiras, por exemplo, se você não pode rotular suas células in vivo, tags, tais como ICAT [3] ou ITRAC [4] pode ser usado extração post para diferencialmente etiqu…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Dr. Rich Rogers de assistência técnica com análises de espectrometria de massa e discussões úteis, e as Dras. Rob Moritz, Jeff Ranish, e Hamid Mirzai para discussões úteis.
Este trabalho foi financiado pelo NIH Centros de Excelência.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
Referencias
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