Een In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Summary

Deze video laat zien hoe cel invasie te meten door middel van celkweek voegt met behulp van een fluorescentie-gebaseerde methodiek.

Abstract

Het kenmerk van metastatische cellen is hun vermogen om binnen te dringen door het basaal membraan en migreren naar andere delen van het lichaam. Cellen moeten in staat zijn om zowel scheiden proteases die breken de basaalmembraan en migreren om te worden invasief. BD BioCoat Tumor Invasion systeem biedt cellen met voorwaarden dat de beoordeling van hun invasieve eigendom toe<em> In vitro</em^1,2. Het bestaat uit een BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate met een 8,0 micron poriegrootte van PET-membraan dat is gelijkmatig is bedekt met BD Matrigel Matrix. Deze uniforme laag van BD Matrigel Matrix fungeert als een gereconstitueerde basaalmembraan<em> In vitro</em> Het verstrekken van een echte barrière voor niet-invasieve cellen, terwijl de presentatie van een geschikte eiwit structuur voor invasie te bestuderen. De coating proces afsluit de poriën van het membraan, het blokkeren van niet-invasieve cellen van migreren door het membraan. In tegenstelling tot invasieve cellen in staat zijn om zich los te maken van en door het gecoate membraan migreren. Kwantificering van de cel invasie kan worden bereikt door zowel pre-of post-cel invasie labelen met een fluorescerende kleurstof, zoals DiIC₁₂ (3) of calceïne AM, respectievelijk, en het meten van de fluorescentie van binnendringende cellen. Sinds de BD FluoroBlok membraan effectief blokkeert de doorgang van het licht 490 tot 700 nm bij> 99% efficiency, fluorescent-gemerkte cellen die niet zijn binnengedrongen worden niet gedetecteerd door een bottom-het lezen van fluorescentie plate reader. Echter, cellen die zijn binnengedrongen aan de onderkant van het membraan niet meer afgeschermd van de lichtbron en worden gedetecteerd met de respectievelijke plaat lezer. Deze video toont een eindpunt cel invasie assay, met behulp van calceïne uur tot binnengevallen cellen te detecteren.

Protocol

Post-etikettering en metingen met behulp van BD calceïne AM fluorescerende kleurstof Cellen worden gelabeld voor kwantificering nadat ze zijn binnengedrongen via de BD Matrigel Matrix en doorgegeven via de BD FluoroBlok membraan. Als gevolg hiervan kan alleen eindpunt meting van de cel invasie worden verkregen. Grow-cellen tot ~ 80% confluentie. Voor te bereiden en te rehydrateren de insert-systeem. Verwijder de verpakking van -20 ° C opslag en laat deze op kamertemperatuur komen. Open de folie verpakking en voeg 500 ul warm (37 ° C) media om de binnenkant van de insert putten. Laat de plaat gedurende 2 uur hydrateren bij 37 ° C, 5% CO 2. Opmerking: Het is niet nodig om de ongecoate BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Systeem dat gebruikt zal worden als een cel migratie controle te hydrateren. Na rehydratie, verwijder het medium van de insert putten zonder de laag van BD Matrigel Matrix op het membraan. Het systeem is nu klaar voor gebruik. Bereid celsuspensies door trypsinizing celmonolagen en resuspenderen de cellen in serum-vrij DMEM bij 5 x 10 4 cellen / ml. Opmerking: Als u gebruik maakt van een andere cel type dat u nodig hebt om het optimale zaaien dichtheid te bepalen. Voor het bepalen van de optimale dichtheid van zaaien voor je mobiele typen op een poreuze ondergrond groei, gebruik van een scala van zaaien dichtheden (cellen / cm 2) dat tussen haakjes het zaaien dichtheid gebruikt op niet-poreuze ondergronden (bv. flessen, schalen en borden). Bijvoorbeeld, als je op dit moment zaad op 2,5 x 10 5 cellen / cm 2, zaad op verschillende cel concentraties tussen 5 x 10 4 en 5 x 10 5 cellen / cm 2 om de optimale eerste seeding dichtheid te bepalen. Voeg 500 ul van celsuspensie (2,5 x 10 4 cellen) aan de apicale kamers. Voeg 750 ul van chemoattractant (5% FBS in DMEM) aan elk van de basale kamers, met behulp van de steekproef poorten voor toegang. Incubeer de BD BioCoat tumorinvasie System en de ongecoate BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate voor 20-22 uur bij 37 ° C, 5% CO 2 atmosfeer. Na de incubatie, verwijder voorzichtig medium van de apicale kamers. Dit kan worden bereikt door flicking de inhoud in een afvalbak. Raak de onderkant van de insert-systeem. Overdracht van de insert-systeem in een tweede 24-wells plaat met 500 ul / putje van 4 ng / mL Calceïne AM in HBSS. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. De Calceïne AM oplossing is niet verwijderd uit de Tweede Kamer vóór het lezen van fluorescentie want het is een nonfluorescent vitale kleurstof die in het groen fluorescent calceïne omgezet door cytosolische esterases. Fluorescentie van binnengevallen cellen wordt afgelezen op golflengten van 494 / 517 nm (Ex / Em) op een bottom-het lezen van fluorescerende plaat lezer. De winst instelling kan nodig zijn om empirisch worden bepaald, maar een middelpunt te krijgen moet een voldoende uitgangspunt. Een winst instelling die te hoog is kan leiden tot verzadiging van de detector met zeer fluorescerende monster, dit kan de overname van zinvolle resultaten te voorkomen. Gebruik van de Automatische versterkingsregeling (indien ondersteund op uw lezer) wordt niet aanbevolen. Een omgekeerde fluorescentie microscoop kan worden gebruikt om uw resultaten te verifiëren, het is vooral nuttig om dit te doen de eerste keer dat u deze test. Opmerking: Het is van het grootste belang dat de Insert-systemen worden gelezen met behulp van de juiste plaat kaart. Voor informatie over het laden plaat kaarten te zien BD Technical Bulletin No 436 op www.bdbiosciences.com of neem contact op BD Technical Support (labware@bd.com). Een goede plaat oriëntatie is met een goed A1 bij de linker bovenhoek en de BD Flacon logo gericht op rechts, zoals de plaat wordt geplaatst in de lezer. Datareductie Worden uitgedrukt als in de volgende vergelijking: Achtergrond kan worden afgetrokken voor de berekening van de cel procent invasie RFU = relatieve TL-eenheden.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
BD BioCoat Tumor Invasion System		BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells		ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control		BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye		BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling		BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities		PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.