البصرية تسجيل النشاط الكهربائي في غينيا الخنازير المعوية باستخدام شبكات الجهد حساسة ملونات
Summary
هذا البروتوكول يوضح كيفية الجهد الحساسة الأصباغ البصرية للتمكن من تسجيل النشاط الكهربائي من الشبكات العصبية سليمة مثل الضفائر للنظام العصبي الخنازير الغينية المعوية ، مع قرار تعديل والتي تتراوح من واحد الى خلايا متعددة الدوائر العقدية.
Abstract
النظام العصبي المعوي (ENS) هو عبارة عن شبكة قائمة بذاتها مع المهام المحددة ، وقادرة على أداء السلوك المعقد في عزلة. يتم ترتيب الخلايا العصبية والخمسين (10-25 ميكرون في القطر) في الضفائر التي تقتصر على طائرات متميزة من جدار المعي<sup> 1</sup> ، ويمكن العثور على الضفيرة العضلية المعوية بين طبقات العضلات الطولية والدائري ، والضفيرة تحت المخاطية بين طبقة العضلات الدائرية والغشاء المخاطي لل. منذ أنظمة المستجيب لهذه الضفائر (نقل ظهارة ، وخلايا الغدد الصماء ، وعناصر المناعة والأوعية الدموية والعضلات الملساء) وترد أيضا ضمن جدار الامعاء ، ويمكن تشريح شبه سليمة الاستعدادات التي تحفظ المكونات الفردية للمنعكس مسارات مختلفة. يتم التحكم في سلوك النظم المستجيب من الضفائر تحت المخاطية والعضلية المعوية التي تعمل بانسجام. لذلك ، معرفة مفصلة من التفاعلات داخل ومتشابك بين العقد ، والتواصل بين الضفائر ، أمر ضروري لفهم وظيفة الجهاز الهضمي الطبيعي. وENS ، ونظام العصبي سليمة ، هو نموذج فريد التجريبية التي يمكن للمرء أن ربط الأحداث الجزيئية والخلوية مع سلوك الكهربائية من الشبكة العصبية الفسيولوجية ومخرجاته. لأن للمنظمة شبه ثنائية الأبعاد من الضفائر والخمسين ، وبشكل خاص يناسب ENS لدراسة الشبكات العصبية باستخدام تقنيات متعددة موقع تسجيل البصرية التي تستخدم الجهد الحساسة الأصباغ<sup> 2،7،8،9</sup>. وسوف نوضح هنا استخدام جديد نسبيا naphthylstyryl – pyridinium صبغ (دى ANEPPDHQ – 4)<sup> 3</sup> هو الذي يوفر مزايا عدة على سابقاتها ، بما في ذلك الضيائية منخفضة جدا ، وبطء الاستيعاب ، والاستقرار الملحوظ الكيميائية. عندما تستخدم بالاقتران مع الكاميرا التي تسمح الفرعي ملي وقت القرار ، وصبغ هذا يسمح لنا لرصد النشاط الكهربائي للخلايا العصبية في كل مجال الرؤية للقرار مكانية القصوى من 2.5 ميكرومتر ~ في التكبير 100X. في أقل التكبير (10X أو 20X) ، يتم تعويض تضحية وحيدة الخلية القرار مكسبا في وجهات النظر ، وكشف عن تعقيدات الدوائر بين العقدية.
Protocol
Discussion
لقد كتب هذا البروتوكول مع هدفين في الذهن. أول واحد هو إقناع المحققين أخرى ، وذلك بفضل التقدم التكنولوجي كثير من العقد الماضي ، مسجلا البصرية النشاط الكهربائي باستخدام الأصباغ الحساسة الجهد قد تصبح واحدة من المنهجيات ، وأقوى موثوقة وبأسعار معقولة لدراسة الشبكات العص…
Acknowledgements
نود أن نشكر DA كولتر (ختم) على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام له 2 الفوتون المجهر للحصول على صور 2 – الفوتون أظهرت في بداية الفيديو ، وتاكانو حاء لتقاسم معنا خبرته الفنية.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
| Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
| Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
| Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
| Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
| Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
| PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
| L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
| Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
| Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
| Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
| Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
| High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
| Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
| Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
| Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
| IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |
Referencias
- Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. . in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M., Barker, J., McKelvy, J. Current Methods in Cellular Neurobiology. , 139-139 (1983).
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
