הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים
Summary
פרוטוקול זה מדגים כיצד מתח רגיש צבעים לאפשר הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית של רשתות עצביות שלמים כגון plexuses של מערכת חזירי הים העצבים enteric, עם רזולוציה מתכווננת אשר נע בין חד תאים למעגל רב ganglionic.
Abstract
מערכת העצבים enteric (ENS) היא רשת עצמאי המזוהה עם פונקציות, מסוגל לבצע התנהגויות מורכבות בבידוד. הנוירונים שלה (10-25 מיקרומטר קוטר) מסודרים plexuses כי מוגבלים מטוסים שונים של דופן המעי<sup> 1</sup>; מקלעת myenteric ניתן למצוא בין שכבות השריר האורך מעגליות, ואת מקלעת submucous בין שכבת השריר עגולים רירית. מאז מערכות עבור מפעיל plexuses אלה (הובלת אפיתל, תאים האנדוקרינית, אלמנטים החיסונית, כלי דם ושרירים חלקים) כלולים גם בתוך קיר הבטן, חצי שלם ההכנות יכול להיות גזור כי לשמר רכיבים בודדים של רפלקס מסלולים שונים. ההתנהגות של מערכות מפעיל נשלטת על ידי plexuses submucous ו myenteric הפועל קונצרט. לכן, ידע מפורט של אינטראקציות הסינפטית בתוך ובין הגרעינים, ואת התקשורת בין plexuses, הוא חיוני להבנת תפקוד תקין של מערכת העיכול. ENS, כמו מערכת העצבים תמים, הוא מודל ניסיוני ייחודי שבו ניתן לתאם אירועים מולקולריים הסלולר עם ההתנהגות החשמלית של הרשת העצבית ותפוקות הפיזיולוגי שלה. בגלל ארגון מעין דו מימדי של plexuses שלה, ENS הוא גם מתאים במיוחד ללימוד רשתות עצביות באמצעות מספר רב של טכניקות הקלטה אופטית אתר המעסיקות מתח רגיש צבעים<sup> 2,7,8,9</sup>. נדגים כאן את השימוש חדש יחסית naphthylstyryl-pyridinium צבען (di-4-ANEPPDHQ)<sup> 3</sup> זה מציע יתרונות רבים על פני קודמיו, כולל phototoxicity נמוך מאוד, קצב איטי של הפנמה, ואת היציבות הכימית מדהים. הפועל בשיתוף עם מצלמה המאפשרת משנה אלפית שנייה זמן רזולוציה, צבע זה מאפשר לנו לנטר את הפעילות החשמלית של כל הנוירונים בתחום של נוף עם רזולוציה מרחבית מקסימלית של ~ 2.5 מיקרומטר בהגדלה 100x. בהגדלה נמוכה (10X או 20X), להקריב את ההחלטה תא בודד הוא פיצוי לזכות בפרספקטיבה, חושף את המורכבות של המעגלים בין ganglionic.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה נכתב עם שני שערים בראש. הראשון הוא לשכנע חוקרים אחרים, בזכות ההתקדמות הטכנולוגית הרבה של העשור האחרון, הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית באמצעות מתח רגיש צובעת הפך אחד, מתודולוגיות החזק ביותר אמינה ובמחיר סביר ללימוד רשתות נוירונים שלמים, ואכן , זה יכול להי?…
Acknowledgements
ברצוננו להודות התובע קולטר (CHOP) עבור ומאפשר לנו להשתמש מיקרוסקופ 2-פוטון שלו לרכוש את 2-פוטון מהתמונות המוצגות בתחילתו של וידאו, וה 'טאקאנו לשיתוף איתנו המומחיות הטכנית שלו.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
| Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
| Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
| Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
| Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
| Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
| PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
| L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
| Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
| Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
| Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
| Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
| High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
| Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
| Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
| Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
| IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |
Referencias
- Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. . in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M., Barker, J., McKelvy, J. Current Methods in Cellular Neurobiology. , 139-139 (1983).
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
