Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

Summary

Se describe un método para el análisis de la alteración de la N-glicanos ligados a través de los primeros años de vida de las glicoproteínas después de su biosíntesis en células de mamíferos. Esto se logra mediante pulso-caza análisis de glicanos metabólicamente etiquetados, liberación enzimática de las glicoproteínas y análisis por HPLC.

Abstract

La unión de la Glc

Protocol

El protocolo está destinada para el análisis de cadenas de azúcares de las glicoproteínas o total de una glicoproteína de interés específico. El procedimiento es básicamente el mismo en ambos casos con algunas modificaciones como se indica a través del protocolo.

1. Para el etiquetado del metabolismo de N-glicanos ligados uno tiene que usar una cultura subconfluentes de células de mamífero cultivadas durante la noche en una placa de 90 mm para cada muestra (muestras pueden representar diferentes puntos de tiempo o de tratamientos). Este protocolo está optimizado para las células NIH 3T3.
2. Comer a las células de la glucosa por la incubación en 5 ml ....

Discussion

El análisis del pulso-caza de los glicanos en las células vivas con una separación de HPLC proporciona un método para el estudio de la dinámica de los oligosacáridos alteraciones estructurales a lo largo de la vida de una glicoproteína. Hay una creciente evidencia de que tales alteraciones están involucrados en la producción de las señales para doblar ER, control de calidad y sistemas de tráfico ^2-5. El método se puede aplicar no sólo para una glicoproteína de interés específico, sino también para analizar la.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Controlador del sistema de suministro multisolvente 600E	Waters WAT062710
Acetonitrile LiChrosolv (grado de gradiente para cromatografía líquida)	Merck & Co., Inc.	1.0003
Microcon Amicon Ultra 0,5 ml 30K o Centricon ultracel YM-30	EMD Millipore	UFC503024 o 4208
Concentrador 5301, incl. 48 x 1,5 / 2,0 ml rotor de ángulo fijo	Eppendorf	5301 000.016
Dializado F– tal Calf Serum	Biological Industries	04-011-1A
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medium	GIBCO, de Life Technologies	41965039
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio - sin glucosa	Sigma-Aldrich	D5030
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
Sal disódica EDTA (Titriplex Iii)	Merck & Co., Inc.
Kit Endo Hf (1.000.000 unidades/ml)	New England Biolabs	p0703S
F– tal Calf Serum (FCS)	Biological Industries	04-001-1A
Colector de fracciones Frac-100	Amersham	18-1000-77
LS 6500 Sistemas de conteo de centelleo líquido	Beckman Coulter Inc.	510720
Manosa, D-[2-3H(N)]- (Actividad específica: 15-30Ci/mmol)	PerkinElmer, Inc.
N-carbobenzoxil-leucinil-leucinil-leucinal (MG-132)	Calbiochem	474790
N-glicosidasa F (1000 unidades/ml)	Grupo Roche 11365177
N-octilglucósido	Sigma-Aldrich	O3757
Células NIH 3T3	Colección de cultivos tipo americano	CRL-1658
Opti-Flour	PerkinElmer, Inc.
Solución de ácido fosfórico (49-51%, para HPLC)	Fluka	79607
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Sigma-Aldrich	P2714
Proteínas A-Sefarosa Perlas	Repligen	IPA300
Conejo policlonal anti-H2 carboxi-terminal 6
Desoxicolato	de sodioSigma-Aldrich	30970
Dodecil sulfato de sodio	Bio-Rad	161-0301
Fosfato de sodio	Sigma-Aldrich	342483
Solución de piruvato de sodio (100mM)	Sigma-Aldrich	S8636
Spherisorb NH2 Columna, 5 μ m, 4,6 x 250 mm	Procesadores	PSS831115
Triton X-100	VWR	306324N
Vibra-Cell VCX 750	Sonics and Materials, Inc.	690-003
tampón A: 1% Triton X-100, 0,5% p/v desoxicolato de sodio, cóctel de inhibidores de la proteasa 2% v/v en PBS
fuerte>tampón B: 0,5% c/v SDS, cóctel de inhibidores de la proteasa 2% v/v en PBS
fuerte>tampón C: tampón de reacción de la N-glicosidasa F: 200mM Na3PO4, pH 8,0, 4mM EDTA, 1,5% N-octilglucósido
NIH 3T3 que expresa de manera estable H2a 6
tampón D: 0,5% Triton X-100, 0,25% p/v de desoxicolato de sodio,0,5% p/v SDS, cóctel de inhibidores de proteasa 2% v/v en PBS
Buffer E: 0.5% c/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt– etanol, cóctel inhibidor de la proteasa 2% v/v en PBS
2-mercapt– etanol	Sigma-Aldrich	M3148