هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة لتوليد المعدلة وراثيا<em> القيطم المورق</em> عن طريق إدخال الجينات المحورة إلى نواة الحيوان المنوي تليها النووية الى زرع بويضة غير مخصبة.
التكامل مستقرة من المنتجات الجينات المستنسخة في جينوم القيطم هو ضروري للتحكم في الزمان والمكان والتعبير ، والتعبير عن الجينات في مراحل لاحقة من التطور الجنيني ، وتحديد مدى القدرة على تنظيم والمروجين التعبير الجيني داخل الجنين. ويمكن استخدام بروتوكول تظاهر هنا لتنتج بكفاءة الأجنة وراثيا القيطم المورق. هذا النهج ينطوي على transgenesis ثلاثة أجزاء : 1. يتم عزل الحيوانات المنوية من نوى عاشرا الكبار خصية المورق عن طريق العلاج مع lysolecithin التي permeabilizes غشاء البلازما المنوية. 2. مستعدة استخراج البيض بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة ، إضافة إلى الكالسيوم يؤدي إلى التقدم إلى استخراج الطور البيني من دورة الخلية ، والطرد المركزي بسرعة عالية لعزل الطور البيني العصارة الخلوية. 3. يتم الجمع بين النواة واستخراج الحمض النووي مع البلازميد الخطي لتكون كما قدم التحوير وكمية صغيرة من انزيم التقييد : زرع النووية. خلال رد فعل قصير ، استخراج البيض decondenses جزئيا لونين الحيوانات المنوية وانزيم يكسر قيود يولد الكروموسومات التي تشجع على إعادة التركيب من التحوير في جينوم. ثم يتم زرع نواة الحيوان المنوي في علاج بويضة غير مخصبة. التكامل بين التحوير وعادة ما يحدث قبل الانقسام والجنينية الأولى من نوعها أن الأجنة الناتجة ليست خيالية. ويمكن تحليل هذه الأجنة دون أي حاجة لتربية للجيل القادم ، والسماح لجيل فعال وسريع من الأجنة وراثيا للتحليلات المروج وظيفة الجين. عاشرا الكبار المورق الناتجة عن هذا الإجراء نشر أيضا عن طريق التحوير germline ويمكن استخدامها لتوليد حيوانات معدلة وراثيا خطوط لأغراض متعددة.
ليتم اختبارها كل بناء المعدلة وراثيا ، ونحن عموما زرع النوى في 500-1000 البيض ، وفي هذا النطاق ، ونحن يمكن أن تولد الأجنة وراثيا التعبير عن ما يصل الى 10 بنيات مختلفة في اليوم الواحد ، اعتمادا على كيفية العديد من الإناث التي يسببها لوضع البيض. هذه زرع حوالي ثلث يلتصق البيض ?…
The authors have nothing to disclose.
يتم توفير التمويل اللازم لعملنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، ومارس من الدايمات ، والجمعية الأميركية للسرطان.
A.Sperm nuclei preparation
Reagents:
Equipment:
B. Preparation of High Speed Extract
Reagents:
Equipment:
C. Nuclear transplantation.
Reagents:
Equipment:
Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4°C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.
Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.
Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.
Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)