La producción de transgénicos Xenopus laevis Integración mediada por la enzima de restricción y transferencia nuclear

Resumen

Este protocolo de vídeo se muestra un método para la generación de transgénicos Xenopus laevis Por la introducción de transgenes en los núcleos de esperma seguido por transplante nuclear en óvulos no fertilizados.

Resumen

La integración estable de productos de los genes clonados en el genoma de Xenopus es necesario para controlar el tiempo y el lugar de expresión, para expresar los genes en las etapas posteriores del desarrollo del embrión, y para definir cómo potenciadores y promotores de regular la expresión génica en el embrión. El protocolo ha demostrado aquí se puede utilizar para producir de manera eficiente transgénicos Xenopus laevis embriones. Este enfoque implica la transgénesis tres partes: 1. Los núcleos de los espermatozoides están aislados de adultos X. laevis testículos mediante el tratamiento con lisolecitina, que permeabilizes la membrana plasmática del espermatozoide. 2. Extracto de huevo se prepara por centrifugación a baja velocidad, además de calcio para hacer que el extracto de avanzar a la interfase del ciclo celular, y una centrifugación de alta velocidad para aislar el citosol de la interfase. 3. Transplante nuclear: los núcleos y el extracto se combinan con el ADN de plásmido linealizado para ser presentado como el transgén y una pequeña cantidad de enzima de restricción. Durante una reacción a corto, extracto de huevo parcialmente decondenses la cromatina de los espermatozoides y la enzima de restricción genera roturas cromosómicas que promueven la recombinación de los transgenes en el genoma. Los núcleos de los espermatozoides tratados son luego trasplantadas en los huevos no fertilizados. La integración del transgén ocurre generalmente antes de la primera división embrionaria de tal manera que los embriones resultantes no son quiméricos. Estos embriones pueden ser analizados sin necesidad de criar a la próxima generación, lo que permite la generación eficiente y rápida de los embriones transgénicos para el análisis del promotor y la función del gen. Adultos X. laevis como resultado de este procedimiento también se propagan los transgenes a través de la línea germinal y se puede utilizar para generar líneas de animales transgénicos con fines múltiples.

Protocolo

Versiones modificadas de este enfoque transgénesis fueron inicialmente descritos en ¹ y ^2.

Los espermatozoides A. núcleos preparación

Este método de preparación núcleos es una adaptación de Murray ^3, pero los inhibidores de la proteasa se ​​han omitido, ya que interfieren con el desarrollo posterior de los huevos trasplantados con núcleos de los espermatozoides. Alícuotas se congelan a -80 ° C y puede ser utilizado en los trasplantes de aproximadamente 6 meses.

Todas las soluciones deben ser preparados y colocados en hielo antes de comenzar la prepara....

Discusión

Para cada constructo transgénico a ensayar, por lo general, el trasplante en los núcleos 500-1000 huevos; a esta escala, podemos generar embriones transgénicos que expresan un máximo de 10 construcciones diferentes por día, dependiendo de cómo muchas mujeres se ven inducidos a poner sus huevos. De estos trasplantes, aproximadamente un tercio de los huevos y se unirá el 60-80% de estos embriones cortando proceder a través de la gastrulación normalmente. Dependiendo de las condiciones de reacción utilizadas, entre el 10-5.......

Materiales

Los espermatozoides A. núcleos preparación

Reactivos:

1. 1X MMR (2 mM CaCl _2, 5 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM KCl, 1mM _MgCl2, 100 mM NaCl).
2. 0,1% tricaína metanosulfonato (MS222, éster etílico del ácido aminobenzoico, A-5040 Sigma), 0,1% de bicarbonato de sodio. Se disuelven en agua.
3. Mantequilla Preparación 2X Nuclear (NPB). En el día de la preparación de los núcleos de los espermatozoides, que hasta 30 ml de 2X NPB de alícuotas de las soluciones madre almacenadas congeladas: 500 mM de sacarosa (1,5 M de valores), 30 mM HEPES (stock 1M, se valora con KOH, para que un pH de 7,7 se encuentra en 15 mM), 1 mM trihidrocloruro espermidina (Sigma S-2501, 10 mM de existencias), 0,4 mM tetrahidrocloruro espermina (Sigma S-1141, 10 mM de existencias), 2 mM de ditiotreitol (Sigma D-0632, 100 mM de existencias), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8,0).
4. Utilice el 2XNPB para hacer a. 30ml NPB 1X, b. 10ml 1XNPB 3% de BSA (fracción V, Sigma A-7906), c. 5 ml BSA 1XNPB 0,3%.
5. Lisolecitina: 100 l de 10 mg / ml de L-α-liso-lecitina, yema de huevo (Calbiochem, 440154); disolver a temperatura ambiente antes de su uso. Tienda sólida de valores a 20 ° C. Deseche el polvo de acciones si se vuelve pegajosa.
6. Albúmina de suero bovino (BSA): 10% (w / v) BSA (fracción V, Sigma A-7906) constituyen el 5 ml de agua en el día de la preparación de los núcleos de los espermatozoides.
7. Los espermatozoides de almacenamiento intermedio (1 ml) 1X NPB, el 30% de glicerol, 0,3% de BSA.
8. Tampón de dilución de los espermatozoides: 250 mM de sacarosa, 75 mM KCl, 0,5 mM trihidrocloruro espermidina, espermina tetrahidrocloruro 0,2 mM. Valorar a un pH de 7.3 a 7.5 y almacenar 0,5-1 ml alícuotas a 20 ° C.
9. Hoechst N º 33342 (Sigma B-2261): 10 mg / ml en dH ₂ O, almacenar en un recipiente estanca a la luz a 20 ° C.

Equipos:

• Rotor basculante y centrifugar
• estopilla
• herramientas de disección (pinzas y tijeras)
• microscopio de fluorescencia
• embudo
• guantes
• hemocitómetro
• agujas (calibre 26)
• toallas de papel
• placas de Petri (60 mm)
• pipetas
• de plástico (5 y 10 ml)
• Pipetman consejos (1 ml y 200μl)
• Jeringas (1 ml)
• tubos (14 ml; Falcon, 2059)
• tubos
• microcentrífuga (1,5 ml)

B. Preparación del extracto de alta velocidad

Reactivos:

1. 1X Marc Modificado Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM de KCl, MgCl2 1 _mM, CaCl2 ₂ mM, 5 mM HEPES, pH 7,5. Preparar un 10X, y ajustar el pH con NaOH a 7,5.
2. Extracto 20X buffer (RE) de sales: 2 M KCl, 20 mM MgCl _2, 2 mM CaCl _2, filtro esterilizar y almacenar a 4 ° C.
3. Extracto de buffer (XB, recién preparados y almacenados en hielo): 1X sales XB, 50 mM de sacarosa, 10 mM HEPES (1 M de valores, se titula con KOH, para que el pH es de 7,7 cuando se diluye a 15 mm, filtro de esterilizar y almacenar en alícuotas a 20 ° C). Prepare unos 100 ml.
4. 2% (w / v) de L-cisteína clorhidrato de 1-hidrato: Hecho en 1X sales XB antes de su uso y pH a 7,8 con NaOH. Prepare unos 300 ml.
5. CSF-XB: 1X sales XB, 1 mM MgCl ₂ (además de _MgCl2 presentes en las sales de XB, concentración final 2 mM), HEPES 10 mM, pH 7,7, 50 mM de sacarosa, 5 mM EGTA, pH 7,7. Prepare 50 ml.
6. Inhibidores de la proteasa: Mezcla de leupeptina, quimostatina, y pepstatina, cada uno disuelto a una concentración final de 10 mg / ml en dimetilsulfóxido (DMSO). Tienda en pequeñas alícuotas a 20 ° C.
7. 1 M _de CaCl2.
8. Mezcla de energía: 150 el fosfato de creatina mM, 20 mM ATP, 20 mM MgCl _2.
9. Embarazo gonadotropina de suero de yegua (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc., 021 825). Se disuelven en agua y se almacena a 20 ° C.
10. Gonadotropina Coriónica Humana (HCG): 1000 U / mL hCG (CHORULON ®, Intervet, Inc., 057 176). Disolver en agua y se almacenan a 4 ° C.

Equipos:

• Xenopus laevis mujeres
• Agujas (18 y calibre 26)
• Pipeta Pasteur
• de ancho diámetro
• Jeringas (1 ml)
• Tubos de microcentrífuga (0,5 ml)
• Tubos de pared gruesa de policarbonato (Beckman, 349622)
• Tubos, ultraclaros (14 x 95 mm; Beckman, 344060)
• Ultracentrífuga y rotores (por ejemplo, Beckman TL-100 con rotores SW 40 Ti y TLA-100.3)
• Vasos para la recolección de huevos
• Cubos o contenedores para la celebración de las ranas hembra (por ejemplo, 4-L vasos de plástico con tapas de malla).

C. transplante nuclear.

Reactivos:

1. 2,5% de agarosa en 0.1XMMR (para la fabricación de platos de la inyección)
2. 2,5% de cisteína en 1XMMR, PH 8,0, preparada en el día de uso
3. Ficoll
4. 10 mg / ml de gentamicina (stock 1000X)
5. de alta velocidad extracto de huevo (véase más arriba)
6. 100 _MgCl2
7. MMR de 10 aumentos (ver más arriba)
8. Enzimas de restricción (por ejemplo, NotI de New England Biolabs)
9. Buffer de dilución de esperma (SDB; ver más arriba) y los núcleos de los espermatozoides (ver arriba)
10. Gonadotropina Coriónica Humana (HCG) que el anterior
11. aceite mineral (Sigma, M8410)
12. Plásmido linealizado para ser presentado como el transgén: Prepare plásmido linealizado a una concentración de 100 ng / l en agua estéril, agua libre de nucleasa (evitamos Tris y EDTA que contienen buffers, que son algo tóxicos a los embriones). La enzima de restricción utilizada para linealizar el plásmido no tiene por qué ser la misma que la utilizada en la reacción de transferencia nuclear. Por lo general, el uso NotI para todas las reacciones, a pesar de lo plásmido linearizado con. Algunos de calibración de la dilución de la enzima utilizada en la reacción puede ser necesario, la enzima que en exceso puede causar efectos adversos en la post-gástrula desarrollo. Plásmido puede ser purificado de varias maneras diferentes: por lo general utilizan el kit de purificación de Qiagen Qiaquick PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante, la purificación de una sola banda de un gel no es necesario. Si el plásmido se purifica con fenol / cloroformo extracción y precipitación con etanol, asegúrese de eliminar todos los restos de materia orgánica y etanol.

Equipos:

Platos de agarosa para la inyección: En un plato de Petri de 60 mm de plástico, había un pequeño peso 35mmX35mm barco en el 2,5% de agarosa fundida en 0.1XMMR agua para crear una depresión con un fondo de agarosa recubiertas con relleno de huevos. Una vez que se ha endurecido de agarosa, envolver en parafina y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Haga 2-3 platos de antemano para cada reacción de transgénicos va a hacer.

Bomba de infusión: Usamos una bomba de jeringa única infusión de Harvard Apparatus, equipado con una jeringa de 3 ml / aguja llena de aceite mineral (Sigma M-8410). Mitigar la punta de la aguja de jeringa (para evitar que la tubería de perforación) y conecte el tubo de Tygon bien. Funcionar la bomba a ~ 10nl/sec, lo que supone que el tiempo que la aguja está en cada huevo no será superior a 1 seg. La bomba debe ser pre-corra por varios minutos antes de la transgénesis de partida para el día para asegurar que el émbolo de la jeringa esté alineada con el pistón y flujo constante positiva de petróleo de la tubería que está ocurriendo.

Agujas para las transferencias nucleares. El uso de un extractor de micropipeta, generar agujas con puntas de largo e inclinado. Clip estos con una pinza en un microscopio equipado con un micrómetro ocular para obtener un ~ 80 micrones de abertura con forma de bisel.

Otros equipos: Xenopus laevis mujeres, microscopio estereoscópico, incubadora, micromanipulador, extractor de microinyección aguja (por ejemplo, modelo P-87, Sutter), agujas de jeringas (calibre 26), agujas de vidrio microinyección, micrómetro ocular calibrado para el recorte de las puntas de aguja de microinyección de diámetro 80μm, placas de Petri, pesan los barcos de 35 mm, tubo Tygon (ID = 1 / 32 de pulgada, OD = 3 / 32 pulg)