Single Worm PCR: Eine Methode zur Extraktion und Amplizät genomischer DNA

Abstract

Quelle: Prior, H., et al. Eine schnelle und einfache Pipeline zur Erzeugung von Genom-Punktmutanten in C. elegans mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteinen. J. Vis. (2018). 

Dieses Video beschreibt eine Technik, um schnell eine einzelne Nematode auf einen genetischen Marker durch PCR-Screening zu überprüfen. Im Beispielprotokoll wird auf CRISPR-basierte Genombearbeitung überprüft.

Protocol

Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018). Single Worm PCR und Genotypisierung Nach 1 – 2 Tagen Eiablage die F1s mit einem Wurm-Pick in einzelne PCR-Streifenrohrkappen mit 7 l Wurmlysepuffer ge…

Representative Results

Abbildung 1. CRISPR-Cas9-Konstruktion desC. eleganssod-1-Lokus. (A) Schematische Abbildung der Exon-Intron-Struktur des Sod-1-Lokus in C. elegans. Der rote Balken bezeichnet die Lage von G93 in exon 3. Das Grundierungspaar wird durch die roten Pfeile (F1-R1) notiert. (B) Sequenzausrichtung von humanen und …

Materials

Nuclease-free water	Synthego Inc.	provided with the sgRNA kit EZ kit
KCl	Sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780