Este documento tiene como objetivo instruir al lector en la operación de una fuerza integrada atómica microscopio óptico de imagen para la estimulación mecánica de las células vivas en la cultura. Un protocolo de paso a paso se presenta. Un conjunto representativo de datos que muestra la respuesta de células vivas a la estimulación mecánica se presenta.
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Artículo de método
Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y
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Resumen
Resumen
Para entender el mecanismo por el cual las células vivas sentido las fuerzas mecánicas, y cómo responden y se adaptan a su medio ambiente, una nueva tecnología capaz de investigar el comportamiento de las células a nivel subcelular con alta resolución espacial y temporal se ha desarrollado. Por lo tanto, un microscopio de fuerza atómica (AFM) se integró con la reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía y el disco de giro rápido (FSD) microscopía confocal. El sistema integrado es ampliamente aplicable a través de una amplia gama de estudios moleculares dinámicos en cualquier célula viva adherente, permitiendo una imagen óptica directa de las respuestas celulares a la estimulación mecánica en tiempo real. Reorganización significativa de los filamentos de actina y adhesiones focales se demostró debido a la estimulación mecánica local en la superficie celular apical que los cambios inducidos en la estructura celular en todo el cuerpo celular. Estas técnicas innovadoras que proporcionan nueva información para la comprensión de la reestructuración de células vivas y dinámicas, en respuesta a una fuerza mecánica. Un protocolo detallado y un conjunto de datos representativos que muestran la respuesta de células vivas a la estimulación mecánica se presentan.
Protocolo
1. Panorámica del sistema de microscopio integrado
El sistema de microscopio que se utiliza para estos estudios se ha descrito en detalle 1. En pocas palabras, un invertido Olympus IX-81 con microscopio TIRF adjunto (Olympus, Center Valley, PA) se combina con la CSU-22 Yokogawa cabeza de lectura (Yokogawa Electric Inc, Japón). Un microscopio de fuerza atómica Bioscope SZ (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) está montado en la parte superior del microscopio invertido óptica, y todo el sistema se coloca en la parte superior de una tabla de grados de investigación óptica (Newport, Irvine, CA).
El m....
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Discusión
Adherencias citoesqueleto 07.10 y focal 11-16 son estructuras dinámicas que reúnen, se dispersan y vuelta como las células migran o responder a la fuerza mecánica 17. Tienen funciones importantes en la regulación del crecimiento celular, la supervivencia, y la expresión génica. Conocer su distribución específica y la dinámica proporciona una mejor comprensión de cómo se comunican las células con la matriz y entre ellos.
Este sistema nuevo microscopio es ampli.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Plásmido vinculina-GFP fue un regalo de Kenneth Yamada, Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial, Bethesda, Maryland, y la actina mRFP plásmido fue un regalo de Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, Florida.
Este trabajo fue apoyado por el premio de su carrera NSF # 0747334 y AHA-Nacional SDG # 0835205N a Andreea Trache.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Punta de AFM | Novascan Technologies, Inc. | Bola de borosilicato de 2 micrones, 0,01 N/m, superficie con biotina | |
| Avidina | Sigma-Aldrich | A9275 | 1 mg/mL en DPBS |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Kit de transfección Amaxa para células musculares lisas | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Placas MatTek con fondo de vidrio | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Placas Falcon estériles de 60 mm con cubreobjetos de vidrio no. 1.5 en el fondo |
Referencias
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Tay....
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Reimpresiones y permisos
