세 단일 파장 짧은 펄스 레이저의 조합 일관된 안티 – 스톡 래맨 산란 (자동차)과 이중 – 공진 자동차 (DR – 자동차)를 생성하는 데 사용됩니다. 이러한 신호의 차이점은 약한 래맨 scatterers의 이미징을함으로써 일관된 래맨 신호를 감지 않으면 어려운위한 향상된 감도를 제공합니다.
코히어런트 래맨 이미징 기술로 인해 높은 분자 특이성 1 라벨이없는 광학 이미징을 사용하는 그들의 약속에 대한 지난 10 년간 활동에 극적인 증가를 보았다. 이러한 기술의 감도 그러나, 밀리 어금니 분자 농도의 1,2을 필요로하는, 형광보다 약한 정도의 많은 명령입니다. 여기, 우리는 강한 또는 풍부한 래맨 scatterers에서 얻은 자신의 신호를 증폭하여 래맨 – 활성 분자의 약하거나 낮은 농도의 검색을 활성화할 수 방법을 설명합니다. 생물 학적 샘플에서 짧은 펄스 레이저의 상호 작용은 샘플에 대한 고유의 화학적 정보를 가지고 각각의 일관된 래맨 산란 신호의 다양한 생성합니다. 일반적으로 이러한 신호, 예를 들어 일관된 안티 – 스톡 래맨 산란 (자동차)의 하나는 다른 사람이 폐기하는 동안 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 그러나, 3 색 자동차, 4 파 혼합 (FWM)를 포함한이 다른 신호, 수집 및 자동차 신호에 비해 때, 정보를 검색하는 데 그렇지 않으면 어려운 3을 추출하실 수 있습니다. 예를 들어, 이중 – 공진 자동차 (DR – 자동차) 2 공진 신호 4 사이에 건설적인 간섭의 결과입니다. 우리는 보여주는 방법 lipids에 2,845cm -1 CH 스트레치 진동 및 진정제를 맞았 분자 (예 : 진정제를 맞았 설탕, 지방산 등)의 2,120cm -1 CD 스트레칭 진동 DR – 자동차 신호를 생성하는 데 필요한 세 가지 레이저의 튜닝 동시에 래맨 resonances을 알아내기 위해 이용하실 수 있습니다. 이러한 조건에서, 각 공명 모두도 생성 탐색 결합 DR – 자동차 신호에서 차량 신호뿐만 아니라 인치 DR – 차량 신호와 약한 신호 감도를 향상하는 데 사용할 수있는 풍부한 분자의 진동에서 증폭 신호의 차이를 검출하는 방법 우리는 보여줍니다. 우리는 더 이상 이러한 접근 방식도 용매의 강한 래맨 신호를 사용하는 예를 들면 희석 용질의 약한 래맨 신호를 향상시킬 수있는 이러한 두 신호가 서로 다른 분자에서 생성된 응용 프로그램에 확장 것을 보여줍니다.
래맨 분광법과 래맨 기반 이미징은 생체 과학의 강력한 새로운 도구입니다. 현재이 생체내와 lipids 처리 및 저장에 세포의 대사와 신진 대사 장애의 체외 연구에서 특히 사실입니다. 대부분의 바이오 macromolecules은 세포와 유기체에서 얻은 래맨 스펙트럼은 일반적으로 lipids, 단백질, 핵산, 당분의 기부금의 회선되도록 비슷한, 대부분 탄소 기반의 분자 채권의 큰 숫자를 포함하는 등 Lipids은 비교적 쉽습니다 때문에 밀도 방울이나 bilayers를 형성하기 위해 경향과 그들이 지방족 CH 채권의 큰 번호와 확장 체인을 포함하기 때문에, 이러한 복잡한 스펙트럼에서 분리합니다. 복잡한 세포 환경 내에서 특정 단백질, 아미노산, RNA 또는 DNA를 분리하는 능력은, 그러나 매우 제한됩니다. 관심이 분자는 아래에서만 μm의 농도에 존재하고있다면 이것은 특히 사실입니다. 여기, 우리의 새롭게 도입된 DR – 자동차의 차이 이미징 기술을 이용하여 약한 래맨 resonances을 탐사하는 능력은 그들의 화학 microanalysis 및 이미징을위한 잠재적으로 강력한 방법을 제공합니다. 틀림없이,이 프로토콜의 가장 복잡한 부분은 레이저 시스템의 정렬 및 동기화됩니다. 처음부터 시작하면, 펄스의 동기화, 즉 펄스가 그들이 펄스 autocorrelator의 사용에 의해 용이 걸릴 수있는 다른 경로에도 불구하고 시간에 overlapped 것을 보장. 일단 공간과 시간적 중복은 달성 자동차 DR – 자동차 신호를 쉽게 감지할 수 있어야합니다. 그러나, 최초의 정렬이 약하 신호의 결과로, 자주 원유입니다. 이 시스템을 잘 정렬을위한 가장 좋은 연습은 처음에 약한 신호를 생성하고 다음 각 경로를 따라 부드럽게 조정 거울 및 지연 단계를 사용하여 시간적 중복을 조정하여 신호 강도를 향상시키는 것입니다. , 룸 빛이 매우 효율적인 배플로 깨끗한 결과가 객실 조명으로 시스템을 운영함으로써 얻을 수있는 분광계 / 단색 행위가 비활성화 및 커튼 또는 렌즈 튜브는 다양한 광원 (예 : 컴퓨터 모니터의 도입 배경을 최소화하기 위해 있지만 표시기 조명, LED가 등).
우리의 특별한 설정은 단일 광자 계수의 눈사태 사진 다이오드 (APD) 감지기와 감지 5 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 하드웨어를 활용합니다. 이것은 비교적 낮은 소음이 있지만 여러 그룹에서 비슷한 측정을 만드는 유리 가변 이득과 함께 사진 배율 튜브 (PMT의) 발견 매우 약한 신호를 감지할 수 있습니다. PMT의 장점은 그들이 가변 이득을 제공하고 검출기의 정렬을 단순화하는 수있는 훨씬 더 큰 탐지 영역을 가지고있다. 또한, 설치 프로그램은 빔 스캔을 달성하기 위해 목표를 번역 압전의 단계를 사용합니다. 이 장점은 우리가 정확도 높은 학위를 이전에 스캔한 이미지 이내에 현장으로 돌아가 자연 래맨 스펙트럼을 포함하여 추가적인 측정을 취할 수있는 능력을 가지고있다. 다른 그룹은 스캐닝 미러 어셈블리, 또는 훨씬 빠르게 이미지를 제공하고 있지만 정확하게 이미지 내의 임의의 위치로 돌아가려는 능력 제한됩니다 올림푸스 FluoView 시스템으로도 전체 공촛점 스캔 장치를 이용하여 성공적으로되었습니다.
래맨 공명도 몇 가지 최적화가 필요할 수도 있습니다 중요한 단계와 일치하도록 레이저를 튜닝. 래맨 봉우리가 DR – 자동차와 자동차에서 얻은 최대 스펙트럼 피크 강도를 알고있을 수 있지만 반드시 자연 래맨 피크의 최대과 일치하지 않습니다. 이것은 자연 래맨 스펙트럼에 대한 상대 차량의 스펙트럼 왜곡이 아닌 공진 배경 신호 및 차량에 최고의 안경 웨이브 혼합에 의해 생성된 신호의 본질적인 간섭 때문입니다. 자동차 신호의 피크 스펙트럼 위치 계산하지만,보다 실용적인 접근 방식 래맨 공명의 예상 위치에 걸쳐 여러 개의 작은 스펙트럼 단계 OPOs를 조정하는 것입니다 수 있습니다. 이 프로세스는 명확 최대를 얻을 것입니다. 사실, DR – FWM에서 가장 감성 모두를위한 resonances이 최대로 조정해야합니다.
DR – 자동차 접근법 중 하나는 마지막으로 잠재적인 문제도 논의되어야, 즉 DR – 자동차 신호 래맨 활성 확장 분자의 균일한 분포에 따라 달라집니다. 대부분의 생물 학적 개체의 경우이 잘 풍부하고 거의 편재는 물에서 광범위한 오의 공명이 될 수 있습니다. 물 그러나, 지질 모드를 증폭하기 위해 물의 공명을 이용하면 얻은 신호의 왜곡을 선도하는 등 지질 방울로 세포와 소수성 영역, 대상에서 제외됩니다. 우리의 예제에서, 우리는 우리의 생물 학적 샘플에 대해 쉽게 감지하고 풍부한 신호를 생성하기 위해 진정제를 맞았 포도당의 솔루션을 사용하고 있습니다. 마찬가지로, 물을 진정제를 맞았 또는 생물 학적 buffe를 진정제를 맞았같은 D – HEPES로 RS는 사용할 수 있습니다. C. 이내 예제에서는 지질이 방울 엘레간스 웜은 항상 시스템의 초점을 맞춘 레이저 스폿 이내에 진정제를 맞았 포도당 솔루션과 lipids 모두 포함할 정도로 작은되었습니다. 그러나 이것은 일반적으로 사실이 아니다. 특정 예제는 세포질 내에 비교적 큰 지질 방울을 생성 adipocytes, 것입니다. 이 의미는 DR – 자동차 기술로 실시하는 실험 결과를 확인하는 신중 준비 및 제어 실험을 필요로합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 DR – 자동차 기술을 개발하고 그들의 공헌에 대한 이완 Schie과 세바스찬 Wachsmann – Hogiu 감사하고 싶습니다. 타일러 윅스 로렌스 리버 모어 국립 연구소의 로렌스 학술 프로그램에 의해 지원을 인정한다. 토마스 허저는 보조금 프로그램을 통해 미국 심장 협회의 지원에 감사합니다. 이 작품 또한 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 기금에 의해 일부 지원되었다. Biophotonics, NSF 과학 기술 센터를위한 센터는 공동 계약 번호 PHY 0,120,999 아래 캘리포니아 데이비스 대학에 의해 운영됩니다. 지원도 연구 자원 (NCRR)에 대한 국립 센터에서 부여 번호 UL1 RR024146 아래 UCD 임상 Translational 과학 센터에서 인정받고 있습니다.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |