Gusanos transgénicos se utilizan comúnmente en C. elegans La investigación. Descrito es un protocolo simple, pero eficaz, para introducir transgenes en los gusanos usando bombardeo biolística con partículas de oro recubiertas de ADN. El esfuerzo que implica y los resultados de los bombardeos se comparan favorablemente con microinyección para la generación de animales transgénicos.
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Artículo de método
Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística
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Resumen
Resumen
El número de laboratorios que utilizan el nematodo C. vida libre elegans está creciendo rápidamente. La popularidad de este modelo biológico se atribuye a un tiempo de generación rápida y corta vida, fácil mantenimiento y bajo costo, el genoma secuenciado en su totalidad, y la variedad de recursos de ARN de interferencia y los animales mutantes. Además, el análisis de la C. elegans genoma revela una gran similitud entre los gusanos y los vertebrados superiores, lo que sugiere que la investigación en los gusanos podrían ser un complemento importante a los estudios realizados en ratones enteros o células cultivadas. Una parte muy importante de la investigación y el gusano es la capacidad de utilizar animales transgénicos para estudiar la localización de genes y su función. Los animales transgénicos pueden ser creadas a través de la microinyección de la línea germinal o gusano a través del uso de bombardeos biolística. El bombardeo es una técnica más reciente y menos conocida de una serie de laboratorios. A continuación se describe un protocolo sencillo para generar gusanos transgénicos por el bombardeo con partículas de oro biolística con el Bio-Rad PDS-1000 del sistema. En comparación con microinyección de ADN en la línea germinal hermafrodita, este protocolo tiene la ventaja de no requerir habilidades especiales de los operadores en lo que respecta a la identificación de la anatomía del gusano o la realización de la microinyección. Además varias líneas transgénicas se obtienen generalmente a partir de un bombardeo sola. También a diferencia de la microinyección, el bombardeo biolística produce animales transgénicos con ambas matrices extracromosómico y transgenes integrados. La capacidad de obtener integrada líneas transgénicas puede evitar el uso de protocolos mutagénico para integrar ADN ajeno. En conclusión, el bombardeo biolística puede ser un método atractivo para la generación de animales transgénicos, en especial para los investigadores no están interesados en invertir tiempo y esfuerzo necesario para aprender a microinyección.
Protocolo
Información general
Tradicionalmente los gusanos transgénicos fueron generados por la microinyección de ADN transgénico en el C. elegans germinal 1,2,3,4. Mientras el éxito, este enfoque requiere de equipo especializado y el desarrollo de la experiencia con la anatomía del gusano y la técnica de microinyección. Más recientemente, el bombardeo biolística ha sido desarrollado como un enfoque alternativo que utiliza el ADN partículas recubiertas de oro para introducir ADN extraño en la línea germinal 5,6. Este enfoque requiere menos inversión de tiempo en términos de práctica para tener éxito.
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Discusión
Biolística bombardeo es un método sencillo para introducir ADN extraño en muchos organismos, incluyendo C. elegans 1,5,6,7,16. Se basa en las partículas de oro formando un complejo con el ADN en presencia de CaCl2. Poliaminas catiónicas, tales como la espermidina, proteger el ADN de la degradación de la nucleasa en vivo. Dado que la espermidina es una molécula inestable, es importante guardarla en pequeñas alícuotas a -20 ° C, y que la solución adecuada antes de realizar el bombardeo. Como.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos de la semilla de la Universidad de Pittsburgh y los NIH AG028977 a ALF
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Partículas de oro | Inbio gold | BD021 | 1micron |
| Kit para midiprep | Qiagen | 12143 | |
| Espermidina | Sigma-Aldrich | S4139 | |
| Protamina | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Macroportadores | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Sistema PDS-1000/He Hepta | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Disco de ruptura | Bio-Rad | 165-2330 | |
| Nistatina | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Estreptomicina | MP Biomedicals | 100556 |
Referencias
- Evans, T. C. Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA tr....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.
The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect.
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