Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Summary

Tüm montaj<em> In situ</em> Hibridizasyon (DİLERİZ) diseksiyonları omurgalı ek olarak bir üst düzey lisans Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji dersinin kullanılmıştır. Bu öğrencilerin yanı sıra brüt anatomi gibi bir ders çalışma içinde organizma ve moleküler biyoloji bağlayan gen ekspresyonu çalışma fırsatı verdi.

Abstract

In situ hibridizasyon Tüm montaj (DİLERİZ) moleküler biyoloji laboratuvarlarında bütün montaj numune içinde spesifik mRNA transkript yerelleştirme yoluyla gen ekspresyonu çalışma için kullanılan yaygın bir tekniktir. Bu tekniği (Albertson ve Yelick, 2005 adapte), bir üst düzey lisans Syracuse Üniversitesi'nde Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji laboratuar sınıf kullanıldı. Karşılaştırmalı Omurgalılar Biyolojisi lab dersinde ilk üçte ikisi, öğrencilerin öncelikle geleneksel diseksiyonlar ve modellerin kullanımı ile çeşitli kordalı takson temsil eden çeşitli organizmaların embriyoloji ve brüt anatomi çalışma fırsatı verdi. Dersin son bölümünü DİLERİZ zebrafish embriyolar yapıldı moleküler teknikler kullanılarak omurgalı gelişme gözlem yoluyla anatomi öğretim yenilikçi bir yaklaşım söz konusu. Heterozigot fibroblast büyüme faktörü 8 (fgf8a) mutant hattı, as, kullanılmıştır. Mendel kalıtım nedeniyle, ace üretilen vahşi tip, heterozigot ve homozigot ace/fgf8a mutantlar 01:02:01 oranı intercrosses. Orta hatta ve kalp, Somitlerin, tailbud, myotome, ve beyin gibi anatomik yapıların geliştirilmesi bilinen ekspresyonu RNA probları kullanılır. DİLEĞİYLE öğrencilerin sınıfta boyanma reaksiyonu gerçekleştirirken, 13 hücre gruplarının ve prim-6 kademeli zebrafish kullanılarak yapıldı. Gelişmenin farklı aşamalarında zebrafish embriyoların çalışmada, öğrencilerin bu anatomik yapıların ontogeny içinde nasıl değiştiğini gözlemlemek için yeteneği verdi. Buna ek olarak, bazı ace/fgf8a mutantlar uygunsuz kalp döngü ve hücre gruplarının ve beyin gelişimi hatalarına görüntülenir. Bu laboratuvarda, öğrencilerin yanı sıra, gen ekspresyonu hem de dış anatomi kullanarak çeşitli organ sistemlerinin normal gelişimini gözlemledi. Onlar da yanlış anatomik gelişimi ve gen ekspresyonu (yani varsayılan mutantlar) gösteren embriyolar tespit ve tanımlanmıştır.

Zaten gerekli donanımları kendi kurumlarında veya laboratuvar ve müfredat inovasyon için fon sınırlı eğitmenler için reaktifler ve cihazları finansal maliyet, zaman ve çaba parçası gerekli, dikkate alınması gereken bir faktör olabilir ayarı ne olursa olsun eğitmen. Bununla birlikte, sınıf laboratuar ortamında bu tip DİLERİZ kullanımı gelişim genetiği ve anatomi arasında önemli bir bağlantı sağlayabilir iddia. Teknoloji gelişmeler ve moleküler düzeyde organizma geliştirme çalışma yeteneği daha kolay, ucuz ve giderek daha popüler hale geldikçe, birçok evrimsel biyolog, ekolojistler, fizyoloji, moleküler biyoloji alanında araştırma stratejileri yönelmektedir. Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji laboratuvar sınıfta İSTEDİKLERİ kullanarak moleküller ve anatomisi tek bir ders içinde yakınsama nasıl bir örnektir. Bu üst düzey üniversite öğrencileri daha çeşitlendirilmiş bir eğitim ve gelecek disiplinler arası bilimsel araştırma teşviki önde gelen modern biyolojik araştırma teknikleri, pratik yapma imkanı verir.

Protocol

1. Plazmid cDNA Hedef Dönüşüm Bölüm I: Plazmid Dönüşüm (Gerekli Zaman: 3 saat artı bir gecede inkübasyon) 42 ° C su banyosunda sıcak SOC besin suyu (reaksiyon başına 500 mcL) Buz üzerinde yetkili hücreleri Çözülme 25 mcL yetkili hücrelere plazmid 1 mcL ekle 20 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. 45 saniye için 42 ° C su banyosu içinde ısı şok hücreleri Hemen 2 dakika boyunca buz üzerinde hücre 42 ° C besin suyu hücrelerin her flakon 500 mcL ekleyin 37 ° C'de 2 saat boyunca dakikada 255 rotasyonlar (rpm) çalkalayınız Plaka 75 Luria Bertani (LB) agar plaklarına mcL dönüşüm karışımı Inkübe plakaları 37 ters ° C gecede Bölüm II: E. coli Kültür (Zaman: 15 dakika artı bir gecede inkübasyon) Bir kültür tüp içine her reaksiyon, kısım 3 ml LB suyu ve 50 mg / ml ampisilin 3 mcL Agar plaka 1 bakteri kolonisi kazıyın ve her kültür tüpüne ekleyin 37 kültür tüpleri çalkalayın ° C 255 rpm gecede Bölüm III: Plazmid Hazırlık (Gerekli Zaman: 1.5 saat) 5 Başbakan FastPlasmid Mini Kit (Katalog # 2300000) kullanarak bir gecede kültürlerden gelen plazmid Isolate Hazırlanan plazmid varlığını kontrol etmek için, etidyum bromür ile boyanmış% 1 Tris-asetat-EDTA (TAE) ve jel kiti yıkandı, DNA çalıştırın 2 Situ DIG etiketli RNA Prob Sentezi Bölüm I: Plazmid lineerleştirilmesi (Gerekli Zaman: 2,5 saat) 1.5 mL mikrofuge'de tüp, bir araya getirir:. Plazmid Hazırlayan: 20 ml Restriksiyon enzimi * 2 mL Tampon ** 10 ml 10X Bovine Serum Albumin (BSA) 10 ml Dietil Pyrocarbonate (DEPC) Su 58 ml 100 mL 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe * Plazmid ile değişir ** Restriksiyon enzimi ile değişir. Bölüm II: Transkripsiyon (Gerekli Zaman: 3 saat) 1.5 mL mikrofuge'de tüp, bir araya getirir:. Plazmid Doğrusal 4 mL 10X Transkripsiyon Tampon ** 4 mL Digoxigenin Etiket Karışımı 4 mL Polimeraz * 2 mL RNaz İnhibitör 2 mL DEPC Su 24 ml 40 ml 1 saat için 37 ° C'de inkübe Polimeraz * 2 mcL ekle 1 saat için 37 ° C'de inkübe Ekle 2 DNaz mcL 37 ° C'de 20 dakika * Plazmid ile değişir ** Polimeraz ile değişir. Bölüm III: Yağış (Gerekli Zaman: gecede inkübasyon, 1 saat 5 dakika artı 2 saat santrifüj ve yeniden askıya alma) 0,2 M EDTA 4 mcL ekle 4M lityum klorür 5 mcL ekle Buz gibi% 100 etanol 150 mcL ekle Gecede için -80 ° C'de 2 saat süreyle inkübe 4 ° C, süzün uzakta supernatant 30 dakika 14.000 rpm'de Santrifüj 7 dakika Kuru pelet 20 mcL DEPC su yeniden askıya 37 ° C'de 5 dakika Bölüm IV: Fraksiyonu – prob boyutu 0,6 kb daha büyük ise gerçekleştirin (Gerekli Zaman: Genellikle hayır, 20 dakikadan fazla prob boyutuna göre değişir) 1.5 mL mikrofuge'de tüp, bir araya getirir:. RNA Probe 20 ml DEPC Su 12 mL Sodyum bikarbonat 4 mL Çamaşır sodası 4 mL 40 ml 60 ° C su banyosunda inkübe edin. Denklemi inkübasyon süresi Duy: Süresi (dak.) = (kb başlangıç ​​istenilen kb) / (0,11 x kb x itibaren istenilen kb) Ortalama istenen büyüklük = 0.6 kb Bölüm V: Final Yağış (Gerekli Zaman: 5 dak.gecede inkübasyon, 1 saat oda ısısında artı 2 saat) santrifüj ve jel elektroforezi için yeniden askıya alma, 1 saat 40 mcL DEPC su ekleyin 8 mcL Sodyum Asetat ekle 1.04 mcL Asetik Asit 240 mcL buz gibi% 100 etanol ekle Gecede için -80 ° C'de 2 saat süreyle inkübe 4 ° C, süzün uzakta supernatant 30 dakika 14.000 rpm'de Santrifüj 7 dakika Kuru pelet 20 mcL DEPC su yeniden askıya Karıştırmak için Vortex Spastine Özgü Riboprop varlığını kontrol için% 1 TAE jel boyanmış, etidyum bromür ile tekrar askıya çözüm çalıştırmak 3. Tüm Dağı Situ Hibridizasyon Bölüm I: Embriyolar fiksasyonu ve Proteinaz K Sindirim (Gerekli Zaman: Fix gecede artı 4 saat saklama için ertesi gün, 2,5 saat depolama Bölüm II) Zebra balığı embriyolar sahnelenen toplayın ve gece 4,% 4 paraformaldehid (PFA) düzeltmek ° C Tween-20 (PBSt) 3 kez 10 dakika her biri için% 0.1 içeren sabit embriyolar yıkayın fosfat tamponlu salin Ince uçlu forseps kullanarak deneysel reaktifler, elle dechorionate embriyolar (gerekirse) embriyoların pozlama sağlamak için Bir saat süreyle% 25 oranında kademeli bir dizi her yıkama, yıkama ve PBSt% 50 metanol dehydrate embriyolar, daha sonra -20 ° C'de% 100 metanol içinde saklamak Kullanıma hazır,% 50 (2 kez) ve% 25 (1 kez), her biri için 10 dakika PBSt metanol yıkama PBSt embriyoların rehidrate. Son olarak, her biri için 10 dakika% 100 PBSt 2 kez yıkayın. Kesin zamanlama PBSt / metanol yıkar için önemli değildir Koyu pigmentleri uzaklaştırmak için PBSt% 10 hidrojen peroksit çözeltisi gerekirse, Bleach embriyolar. Embriyolar, 10-20 dakika boyunca, embriyonun yaşına bağlı olarak hidrojen peroksit çözeltisi inkübe gerektiğini ve mikrofuge'de tüp kapağı hava basıncı birikmesini önlemek için açık kalmalıdır 50 mg / ml proteinaz K ile Digest embriyolar embriyo yaşına bağlı olarak 3-15 dakika PBSt 1:5000 sulandırılmış Re-fix 30 dakika boyunca% 4 PFA embriyolar ve her 5 dakika için, PBSt 3 kere yıkayın Bölüm II: Riboprobes Hibritleşme (Gerekli Zaman: 3 saat artı hibridizasyon için bir gecede, 1.5 saat Bölüm III ertesi gün) 2-3 saat önceden ısıtılmış 70 ° C su banyosunda prehybridization solüsyonu (PHS) embriyo Prehybridize PHS Kaldır 0.5 ml, 70 ° C gece boyunca inkübe hibridizasyon çözüm ve 1.5 mcL önceden sentezlenmiş digoxigenin etiketli riboprobes, ekleyin. Sıcaklık Spastine Özgü Riboprop hedef bağlı olarak birkaç derece içinde dalgalanma Ertesi gün, 70 embriyolar yıkayın ° C PHS her biri için 10 dakika tuzlu 2X-sodyum sitrat (SSC)% 75,% 50 ve% 25 oranında kademeli çözümler, sonra 68, 30 dakika boyunca 0,2 X SSC yıkayın ° C Her biri için 10 dakika oda sıcaklığında Maleik Asit Buffer (MAB) 2 kez yıkayın Bölüm III: Anti-digoxigenin (α-DIG) Antikor Kuluçka (Gerekli Zaman: 3 saat artı engellemek için bir gecede 2,5 saat Bölüm IV ertesi gün) 12 plaka embriyolar transfer Ön blok embriyolar en az 3 saat boyunca oda sıcaklığında 1-2 ml engelleme çözümü Aynı zamanda, bu çözüm engelleme çözümünün ikinci bir birim hazırlıyor ve anti-digoxigenin antikor 1:2000 seyreltilmesi antikor ön blok Blok öncesi çıkarın ve 1-2 ml önceden bloke α-DIG çözüm ekleyin, 4 gece boyunca inkübe ° C Ertesi gün, MAB embriyoların yıkayın. Embriyolarının ilk 5 dakika MAB inkübe izin ver, sonra tampon değişiklikleri gerçekleştirmek ve iki 10 dakika, bir 30 dakikalık ve bir 60 dakikalık zaman aralığı inkübe edin. Kesin zamanlama gerekli değildir Alkalen Fosfataz (AP) tampon her 5 dakika için embriyoların 3 kere yıkayın Bölüm IV: Boyama ve Final İşleme (Gerekli Zaman: 1 saat, geceleme boyama kullanılan Spastine Özgü Riboprop bağlı olarak, gliserol yıkar, gliserol yıkama başına 6-10 saat başına 4 saat gliserol saklanabilir) Boyama yeterli kadar, 1-2 ml boyama çözüm embriyoların plaka folyo ile sarın ve düzenli aralıklarla (her 20 dakika) boyama kontrol Boyanma reaksiyonu durdurmak için her biri için 5 dakika PBSt 2 kez embriyo yıkayın Arka plan boyama kaldırmak için,% 100 metanol sonra 10 dakika yıkar% 25 (1 kez) ve% 50 (2 kez) PBSt metanol kullanarak embriyolar dehydrate Embriyoların% 100 metanol içinde en az 2 saat oda sıcaklığında inkübe izin verin 50% 10 dakikalık yıkama (2 kez) ve% 25 (1 kez) PBSt metanol kullanarak PBSt rehidrate, sonra% 100 PBSt 2 kez yıkayın Lekeli e aktarma4 kademeli bir yıkama, bir dizi ve mağaza kullanarak PBSt% 80 gliserol çözüm mbryos ° C. Tarifler: LB agar plakları 10 g LB agar + 250 mL distile su, otoklav, dokunmatik serin her petri kaplarına dökün 15-20 mL sıcak çözüm, 250 mcL ampisilin, agar katılaşmaya izin LB besiyeri 12,5 g LB Broth + 200 mL distile su, otoklav, kullanmadan önce soğumasını bekleyin. % 1 TAE jel 0.4 g agaroz, 40 ml 1X TAE, 2 mcL etidyum bromür; yük 7 mcL plazmid (cDNA Hedef Plazmid Dönüşüm) veya 3 mcL Spastine Özgü Riboprop ve 4 mcL DEPC su (in situ DIG etiketli RNA Prob Sentezi) + 1 mcL yükleme boya, 5 mcL DNA merdiveni Prehybridization çözüm% 50 formamid, 5X SSC, 9.2mM sitrik asit,% 1 Tween-20 Hibridizasyon çözüm prehybridization çözümü artı 500 mg / ml tRNA ve 50 mikrogram / ml Heparin Maleik Asit MAB-100mm, 150mm NaCl, 0,2 M NaOH,% 0.1 Tween-20, 7.5 pH MAB Engelleme Çözüm-3 parça MAB, 1 kısım% 10 Boehringer engelleme reaktif, 1 parçası ısı kuzu serum devre dışı 9.5 AP tampon-60mm Tris-HCl pH, 60mm NaCl, 30mm MgCl 2,% 0.1 Tween-20 Boyama Çözüm-5-Bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (BCIP) ve Nitro mavi tetrazolium (NBT) AP tampon 4. TEMSİLCİSİ SONUÇLAR Doğru yapıldığında, NBT BCIP ve alkalen fosfataz arasındaki reaksiyon zebrafish embriyo mor bir leke olarak görünmelidir mor bir çökelti oluşacaktır. Riboprobes ilgi gen cDNA ilgili daha önce sentezlenmiş olmalıdır. Bu nedenle, herhangi bir leke görüntülenebilmekte, o belirli gelişimsel aşamada ilgi gen transkripsiyonu edildiği zebrafish alanlarda temsil söylenebilir. Fgf8a (Reifers vd, 1998; Şekil 2); deltaC (Oates ve ark, 2005) Bu dersin amacı, riboprobes aldh1a2 (Begemann ve ark, 2001; Şekil 1, daha önce raldh2) sentezlenmiştir; myod1 (Weinberg ve ark, 1996); shha (. Krauss ve ark, 1993), pax2a (Marka ve ark, 1996; Şekil 3) ve myl7 cDNA (önceden cmlc2; Yelon ve ark, 1999). Boyama, orta hatta ve Somitlerin tailbud, myotome, beyin ve kalp gibi anatomik yapıların bekleniyordu. Ace/fgf8a mutantlar bu yapıların pek çok kusurları olması beklenmektedir . Boyama kolayca standart bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak görüntülendi. (Schoenwolf, 2009; D'Costa ve ark, 2009; Schmoldt ve ark, 2009. Clark, 2003) Ek kaynaklar burada açıklanan benzer teknikleri İSTEDİKLERİ hakkında daha fazla bilgi ve sorun giderme içerir. Şekil 1 aldh1a2 için özel riboprobes ile melezleşmiştir olmuştur zebrafish embriyo 24 saat gübreleme,. Özel boyama, göz, beyin, göğüs yüzgeci tomurcuk primordia ve Somitlerin görülebilir. Anterior, üst, arka alt etmektir. Şekil 2. 13 hücre gruplarının gelişme aşamasında zebrafish embriyo fgf8a için bir prob özel melezleşmiştir olmuştur. Özel boyama telencephalon, sırt diensefalon, orta beyin-Beyin sınır, Somitlerin ve tailbud görülür. Ventral sol, sağ dorsal. Şekil 3 pax2a, sinir sisteminin görüntülenmesi için yararlı güçlü bir belirteç için bir Spastine Özgü Riboprop özel melezleşmiştir 22 saat sonra döllenme zebrafish embriyo. Özel boyama koroid fissür, orta beyin Beyin sınır, otik vezikül ve spinal kord nöronları görülebilir. Dorsal anterior sol görünümü.

Discussion

DİLEĞİYLE Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji laboratuvar ders öğrenciler bilinen gen ekspresyonu görselleştirme yoluyla anatomik gelişimi genetik rollerini anlamalarına yardımcı olmak için kullanılmıştır. Dersin ilk bölümü için, öğrenciler, onlara yeterli zaman, çalışma anlamak, karşılaştırın ve kontrast omurgalı anatomi izin, birkaç farklı kordalı takson temsil organizmalar üzerinde diseksiyonu.

Dersin ikinci bölümü için bir giriş olarak, öğrenciler zebrafish geliştirme ve anatomi açıklayan resmi bir ders verildi. DİLERİZ deney yöntemleri ve beklenen sonuçları da ele alındı. Öğrenciler daha sonra canlı zebrafish somitogenesis ve gelişim prim-6 aşamaları verildi, 2 ve 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) diseksiyon mikroskop altında incelemek için. Bu öğrenciler zebrafish embriyolar neye benzediğini daha iyi bir anlayış ve ontogeny üzerinde meydana gelen morfolojik değişiklikler türleri vermek oldu.

, Bir sonraki laboratuvar oturumda, öğrenciler DİLERİZ daha önce yapılmış olan zebrafish embriyolar verildi. Onlar her gen ilgi (Spastine Özgü Riboprop kullanılan) için gen ekspresyonu incelemek ve açıklamak için istendi. DİLERİZ için kullanılan Embriyolar heterozigot ace/fgf8a hattı üyeleri arasında çiftleşmelerin elde edilmiştir. Mendel kalıtım dayanarak, ace/fgf8a çiftleşmelerin embriyoların% 25 homozigot mutantlar olmak ve bu derste odaklanmış anatomik yapıların birçok kusurlarını sergilemek bekleniyordu. Albertson laboratuarında yayınlanan raporlar ve yayınlanmamış gözlemler göre, beyin ve uygunsuz kalp döngü kusurları Somitlerin hatalarına (Albertson ve Yelick, 2005, kişisel gözlemler Marka ve ark, 1996) yanı sıra, beklenen edildi.

Öğrenciler sunulan her gen ekspresyonu desen için, tüm örnekler, yabani türü (geliştirmenin erken aşamalarında heterozigot hayvanlar vahşi tip kardeşleri ayırt edilemez) ve homozigot mutantlar incelemek istendi. Daha sonra kendi sonuçlarını açıklayan laboratuvar raporları yazmak istedi, ve anatomi ve genetik, hatalı gen ekspresyonu anatomik malformasyonlar nasıl tetiklemiş olabileceğini bilgiye göre.

Öğrenciler, bu heyecan ve merak ile laboratuar egzersiz almak için görünüyordu. En önce İSTEDİKLERİ hiç kullanılmamış olduğunu ve dersin bu bölümünde son derece ilgilenmişlerdir. Öğrenciler ilginç zebrafish embriyolar gen ifadesinin farklı desen bulundu, hatta bazıları açıklanan boyanma böyle bir gülen yüz olarak bilinen desen ve semboller ile ilişkilendirilmesi tarafından görüntülendi. Sonuçlanan laboratuvar raporları, öğrencilerin DİLERİZ protokol ve belirli anatomik yapıları genlerin ifadesi genel bir anlayış vardı gösterdi. Huelsken ve ark, 2002; Geetha-Loganathan ve ark, 2008a;. Geetha-Loganathan ve ark, 2008b Öğrenciler ayrıca belirli genlerin fonksiyonlarını anlamak için gerekli laboratuar sırasında (Stickney ve ark, 2000 İSTEDİKLERİ kullanılarak çalışıldı .) Bazı öğrenciler sınırlı arka plan sinyalizasyon yollarının bilgi ve ilgi gen olduğunu, ancak açıkça görülmüştür. Bu kavramlar hakkında daha fazla bilgi giriş dersi gelecek Karşılaştırmalı Omurgalılar Biyolojisi içerisinde DİLERİZ kullanımı hoş bir ilave olabilir WISH.

Protokol genellikle ders çizelgesi bağlı olarak, arka arkaya dört gün sürer, öğrenciler sadece sınıf ve öğretim geri kalanı için sorumlu olmalıdır deneyinin bir parçası tamamlamak için mümkün olabilir. Öğretim Görevlisi tüm Yukarıdaki adımları gerçekleştirdikten Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji sınıfta, öğrenciler, laboratuvarında boyama reaksiyonları tamamladı. Gerçekleştirmek sınıf İSTEDİKLERİ öğrencilerin tercih edilirse, protokol sınıfın zaman çerçevesine bağlı olarak, çeşitli laboratuvar oturumda yapılabilir alt birimden ayrılabilir. Burada haftada yalnızca bir kez laboratuvar toplantı nedeniyle olduğu gibi öğrenciler, tüm protokol gerçekleştirmek için bu mümkün değilse, öğrenciler, kullanılan Spastine Özgü Riboprop bağlı olarak sınıf başında boyama çözüm ve boyama tamamlandı bir saat içinde. Leke geliştirmek için gereken süreyi her Spastine Özgü Riboprop ve çeşitli deneysel koşullar büyük ölçüde değişir ve sınıfın önünde önceden belirlenmiş olmalıdır. Özellikle, öğrenciler sadece laboratuarda leke gelişmekte olması durumunda, öğretim, sınıf dışında önemli bir zaman ve çaba gerektiren tüm Yukarıdaki adımları sorumlu olacaktır. İstenirse, kısa bir alternatif DİLERİZ için ancak şu anda gelişim genleri için zebrafish-spesifik antikorların hazır olmayan protein yerelleştirme görselleştirmek için antikor etiketleri kullanarak, immünhistokimya olabilir. Başka bir seçenek de farklı omurgalı hayvan türü DİLERİZ gerçekleştirmek için birnd öğrencilerin farklı organizmalar aynı genlerin ekspresyonu karşılaştırmak (. Aramaki ve ark, 2007; Gelişen Model Organizmalar, 2008; Pizard ve ark, 2004 Gelişmekte olan Model Organizmalar, 2010) .

Kullanarak herkesin ortak hedefi Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji ders moleküler biyoloji teknikleri anatomik gelişimini incelemek için nasıl kullanıldığını öğrencilere göstermek için WISH. Ayrıca gen ekspresyonu sadece gelişimsel malformasyonlar değil, aynı zamanda evrimsel bir değişime yol açabilir nasıl değişmiş olarak spekülasyon yapmak öğrenciler için bir fırsat sağladı. Evrimsel gelişim biyolojisi (genellikle "evo-devo" olarak anılacaktır) olarak tanımlandı, hızla büyüyen bu alanda çalışma geliştirilmesi yoluyla bağlantı genotip ve fenotip ve evrimsel değişimin potansiyel mekanistik üsleri aydınlatmak için amaçlamaktadır. Bu alanın yükselişi ile birlikte, daha ekolojistler, organizma biyolog, ve fizyoloji araştırma moleküler teknikler kullanıyorlar. Biz Karşılaştırmalı Omurgalı Biyoloji ders DİLERİZ kullanımı, güncel teknolojik araştırma ve kavramsal gelişmeler ile güncel ve üst düzey biyoloji derslerinin biyolojik altbaşlıklarla birleştirerek daha iyi bir yatay hizalamayı kolaylaştırmak için müfredat yetişmek için yardımcı olacağını ileri sürmektedir. Ayrıca, bu bütünleştirici bir yaklaşım daha çeşitlendirilmiş bir eğitim ve gelecek disiplinler arası bilimsel araştırma teşviki giden öğrencilerin bir dersten bir çeşit biyolojik araştırma teknikleri öğrenme fırsatı sağlayacaktır.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps)		Fisher	2300000
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium		Invitrogen	C404003
LB Agar		Fisher	BP1425-500
LB Broth		Fisher	BP1426-500
Ampicillin Sodium Salt		Fisher	BP1760-5
Isopropanol		Acros	42383-0010
Petri Dish 100 x 20 mm non treated		Laboratory Products Sales	430591
14 ml Culture Tube, Snap Top		Fisher	1495911B
Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA		New England Bio Labs	varies
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml		Sigma	D5758-25mL
Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g		Fisher	s608500
Gal 200 proof Ethyl alcohol		Fisher	04-355-451
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L		Fisher	bp13321
Agarose Low EEO 100 g		Fisher	BP160-100
Ethidium Bromide 10 ml		Sigma	45-E1510
Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose		Fisher	BP655-1
1 kb Full Scale DNA Ladder		Fisher	BP2582200
DIG RNA Labeling Mix		Roche	11277073910
T3 RNA Polymerase		Roche	1031163
T7 RNA Polymerase		Roche	10881767001
SP6 RNA Polymerase		Roche	810274
Protector Rnase Inhibitor		Roche	3335399001
Dnase I, Rnase Free 10,000 units		Roche	4716728001
EDTA molecular biology reagent		Sigma	e5134-500G
Lithium Chloride 100 g		Fisher	L121100
Sodium Carbonate 1 kg		Fisher	BP357-1
Sodium Bicarbonate, 500 g		Fisher	BP328-500
Acetic Acid glacial ACS 500 ml		Fisher	a38500
Paraformaldehyde R 500 g		Fisher	o4042500
PBS Phosphate Buffer Saline 10X		Fisher	bp3991
Tween 20 500 ml		Fisher	bp337500
Methanol 5 L		Fisher	A4124
Proteinase K 50 mg		Fisher	bp170050
Formamide 1 L		Fisher	F841
20x SSC 1 L		Fisher	bp13251
Citric Acid Anhydrous ACS 500 g		Fisher	a940500
Ribonucleic acid transfer type V		Sigma	r7876-2.5KU
Heparin Sodium salt 50 mg		Fisher	bp252450
Maleic acid R 500 g		Fisher	o3417500
Sodium Chloride 500 g		Fisher	s271500
Sodium Hydroxide 500 g		Fisher	s318500
Blocking Reagent		Roche	11096176001
Lamb Serum 500 ml		Invitrogen	16070096
Anti DIG AP fragments		Roche	11093274910
2M Tris Solution 500 ml		Fisher	bp1759500
Magnesium Chloride 500 g		Fisher	m33500
BCIP 3 ml		Roche	11383221001
NBT 3 ml		Roche	11383213001
Glycerol 99% 2.5 L		Fisher	AC158920025
Plate 12 well PS ST w/Lid		VWR	62406-165
Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262861
Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262890
1.6 ml microfuge tube		Laboratory Products Sales	L234401
2 Parafilm 2″ x 250 ft		Fisher	s37441
Transfer Pipet 7 ml		USA Scientific	1020-2520
.1-10 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-3000
1-200 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-0006
101-1000 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-2021
Aluminum Foil		Grocery Store

• Autoclave
• Micro-centrifuge
• 37°C incubator (with shaker)
• 4°C micro-centrifuge
• Water bath
• Vortex
• Gel electrophoresis apparatus
• -20°C freezer
• -80°C freezer
• Rocker/shaker
• 4°C refrigerator
• Dissecting microscope (preferably with a teaching screen or camera)