Summary
Yenidoğan kemirgen omurilik elektrofizyolojik kayıtlar ölçmek için kullanılan ekstraselüler emme elektrot üretimi ve kullanımı bir gösteri
Abstract
Nöral devrelerin ve hareket gelişimi, yenidoğan kemirgen omurilik merkezi desen üreteci (CPG) davranışını kullanarak incelenebilir. Biz disseke kemirgen omurilik, emme, CPG aktivitesinin incelemek için kullanılan elektrotlar, ya da kurgusal lokomosyon imal etmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Kemirgen omurilik yapay beyin omurilik sıvısı konur ve ventral kökleri emme elektrot içine çekilir. Elektrot, piyasada yaygın olarak bulunan emme elektrot değiştirerek inşa edilmiştir. Ağır bir gümüş tel, piyasada bulunan elektrot tarafından verilen standart tel yerine kullanılır. Ticari elektrot cam ucu artan dayanıklılık için plastik bir ucu ile değiştirilir. Biz tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sağlayan boru belirli boyutlarda yapılan elle çizilmiş elektrotlar ve elektrot hazırlar. Veri, bir amplifikatör ve neurogram kazanım yazılım kullanarak toplanır. Sırasıyla, mekanik ve elektrik girişimi önlemek için Kayıtlar Faraday kafesi içinde bir hava tablo yapılır.
Protocol
Elektrofizyolojik kayıtları izole omurilik, sinir devresi, 1 genetik ve gelişimsel değişiklikler ortaya çıkarabilir . Daha önce yenidoğan fare omurilik 2 incelemek için bir yöntem olduğunu göstermiştir . Burada izole omurilik 3 kurgusal lokomosyon kayıt yararlı emme elektrotlar hazırlamak için bir yöntem mevcut.
Düşük sıcaklık alkol lamba 3-5 kullanarak elle çok ince uçlu bir plastik boru elektrot ucu çizilebilir. Plastik boru (PE90, Clay Adams Intramedic TM), uysal bir forma boru yumuşatmak için ateşte tutulur . Boru erimeye başlar ve daha saydam hale geldikçe, ısı kaynağı ve uçları hafifçe dışında çekti kaldırılır. Tüp alev kaldırma zamanlaması plastik daraltmak veya çizilmiş ise bölünmüş değildir sigortalamak için önemlidir. Boru ince kısmı istenen iç çapına uygun bir tıraş bıçağı ile kesilir, numune veya kablosunun segmental düzeyde yaşına tarafından dikte. Hortumun bir o-ring yerleştirme kolaylığı için, 45 ° kesim, kalın bir jilet ile boru sonunda yapılır. Bir halkalı ve o-ring varil elektrot elektrot ucu takmak için kalın sonuna yüklenir.
Özellikle büyüklükteki elektrotlar için izin ve zorlukları önlemek için el-çekme elektrot ipuçları, elektrotlar, kalın bir boru (PE90) küçük bir tüp yerleştirilir kullanılarak inşa edilebilir. Boru uzunlukları kayıt kurulum gereksinimleri için özel ve değişkendir. Biz deneyler 1-3,5 kullanılan ölçümler de sunuyorum. PTFE ince borular (Zeus, Küçük Parça) ve PE90 boru 10cm uzunluğu 1 cm uzunluğunda bir tıraş bıçağı ile kesilir. Küçük tüp biter, onlar ezilmiş veya kapalı değil emin olmak için muayene edilmelidir. Bunlar bir böcek pin (Güzel Bilim Araçları) kullanılarak açılabilir. Bir damla yapıştırıcı (JB Kaynak), PTFE tüp orta yerleştirilir. PTFE tüp ve yapıştırıcı PE90 tüp ağız emme kullanarak PE90 tüp içine çekilir. 45 ° 'lik bir kesim kalın boru sonunda yapılır ve bir halkalı ve o-ring önceki bağlıdırlar.
Halkalı ve BNC konektör ticari bir emme elektrodu vida. BNC konnektör mum mühür kaldırmak için bir saat ksilen batırılmış. Konektörü, sonra suda yıkanır ve kurutulur.
Düşük açılı yan port varil tarafında yapılmalıdır. Bir metal çubuk bir Bunsen beki ile ısıtılır ve düşük bir açıda varil tarafında mevcut deliğe basıldığında. 0.010 inç gümüş tel (PM Sistemleri), 15cm uzunluğunda, on beş dakika için kesilir ve çamaşır ıslatılır. Bu sinyal iletim 6 yardımcı olan bir gümüş klorür kaplama oluşturmak için yapılır. Tel, su ile durulanır, kurutulur, sonra BNC konnektörüne lehimlenmiştir. BNC konnektörü ve gümüş tel BNC konnektör varil tarafında kalması için yeterli oda emme elektrot namlu içine eklenir. Emme boru yan port 2-3cm eklenir. Varil başına yaklaşık 2-3cm silikon enjekte edilir. BNC konektörü elektrot dolgu ileri iterek namlu içine dişli.
Elektrot ucu elektrot ön ucunu dişli. Shrink tüp de yan port emiş hattını güçlendirmek için eklenebilir.
Elektrotlar manyetik standları bağlı ve kayıt çanak yakınına yerleştirilen mikromanipülatörler üzerine monte edilir. BNC koaksiyel kablolar bir amplifikatöre kablolu bir headstage bağlıdırlar. Amplifikatör, veri toplama yazılımı (PolyView) ile bir PC bilgisayar dijital kart için bir analog (National Instruments) bağlı bir adaptör (PolyView) bağlıdır.
Elektrofizyolojik verileri kaydederken, tüm dış parazitleri ortadan kaldırmak için gerekli. Sırasıyla, elektrik ve mekanik bir girişimi önlemek için kayıt çanak, amplifikatör ve baş sahne Faraday kafesi içinde bir hava masaya yerleştirilir.
Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1: piyasada bulunan emme elektrot alkol lambası çekilmiş, ya da piyasada bulunan belirli büyüklükteki plastik boru ile inşa ağır bir göstergesi gümüş tel ve plastik bir ucu eli ekleyerek değiştirilebilir . Buna ek olarak, parafin dolgu daha dayanıklı silikon kalafat dolgu ile değiştirilir.
Şekil 2 emme elektrot hava tabloya ilişkin bir şema (mekanik izolasyonu için), Faraday kafesi (elektrik isolati), amplifikatör ve bilgisayar. Bu hava masa ve Faraday kafesi başvurulan kayıt çanak ve ikinci bir zemin için başvurulan bir zemin olduğunu dikkate alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinir sistemi geliştirme izole kemirgen omurilik kullanarak incelenebilir. Nörotransmitter varlığı, kurgusal lokomosyon desenli elektriksel aktivite 1,3 şeklinde spinal kord oluşturulabilir. Bu ritmik patlamaları 0,2 - 0,5 Hz üretilir ve sol-sağ ve fleksör ekstansör ardalanmasından desenli. Farklı gelişim aşamalarında, bu faaliyetin sağlamlık ve desenler 1 değişir. Genetik mutasyonlar da bu etkinliği 3,5,7 desenlendirme rahatsız. Bu faaliyetin Transgenik ve gelişimsel çalışmalar merkezi desen üreten devre organizasyon içgörüler sağlamak ve genellikle, sinir geliştirme çalışmaları bilgilendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff Salk Biyolojik Araştırmalar Enstitüsü Gen İfadesi Laboratuvarlarında Profesör ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü bir Araştırmacı. Bu çalışma, Christopher ve Dana Reeve Vakfı tarafından desteklenmiştir. Joe Belcovson, Kent Schnoeker Multimedya Kaynakları ve Salk Enstitüsü'nden Mike Sullivan, fotoğraf ve düzenleme ile ilgili yardım sağladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
