Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.
1-3 canlı hücreler bağlamında ortaya çıkan kromatin etkileşimleri: Kromatin immunoprecipitation (ChIP) protein tanımlamak için güçlü bir araçtır. Bu teknik yaygın birincil doku, doku kültürü hücrelerinde daha az bir ölçüde istismar ve olmuştur. ChIP kemirgen embriyonik gelişimin erken dönemlerinde özellikle doku, uygulaması, sınırlı miktarda doku ve embriyonun hücre ve doku tiplerinin heterojenite karmaşıktır. Burada ayrışmış bir embriyonik gün 8.5 (E8.5) embriyo kullanarak ChIP gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Kromatin etkileşimleri tek bir E8.5 embriyo makaslanmış kromatin beş alikotları, denetimleri ve özel protein soruşturma için müfettiş yeterli malzeme sağlar içine kadar bölünmüş olabilir.
Özellikleri, doku-spesifik gen ekspresyonu programlar sırasında kromatin etkileşimleri: Biz protein belge başlamak için bu tekniği kullanmış olması. Kromatin etkileşimleri tüm etkileşimler meydana olsun ayrım yapmadan, bir alt kümesidir, ya da tek bir hücre tipi (ler): Sonuç protein saptanması, çünkü bir embriyo hücre tiplerinin heterojenite mutlaka bu tekniğin uygulama kısıtlar. Ancak, sırasında doku spesifik genlerin incelenmesi veya doku belirli bir gen ekspresyonu başlangıcını izleyen iki nedenden dolayı mümkün. İlk olarak, doku spesifik faktörlerin immunoprecipitation mutlaka faktör ifade edilen hücre tipi kromatin izole eder. İkincisi, gen aktivasyonu ile ilişkili olan post-translasyonel modifikasyonlar içeren koaktivatörleri ve histon, immunoprecipitation sadece gen olan hücre tipi genler ve gen düzenleyici dizileri olmalıdır ya da aktif olmuştur. Tekniği, doku-spesifik gen aktivasyonu olayları incelemek için geçerli olmalıdır.
Örneği aşağıda tarif edilen, bağlayıcı faktör incelemek için bir iskelet kas belirli bir gen promoter E8.5 ve E9.5 fare embriyoları kullanılmıştır. E8.5-9.5 4,5 Somitlerin, gövde, kol ve bacakların iskelet kaslarının formunu hangi habercisi dokularda bulunur. Myogenin iskelet kası farklılaşması 6-9 için gerekli düzenleyici bir faktör. Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar kendi organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Myogenin sadece 6,10 gelişme bu aşamada Somitlerin ifade olduğundan, veri kendi organizatörü myogenin etkileşimleri zaten E8.5 embriyolar iskelet kas öncü hücrelerinde meydana gelmiş olduğunu göstermektedir.
Açıklanan ChIP protokolde, miyojenik regülatör myogenin tek E8.5 ve E9.5 embriyolar bulunan, iskelet kas habercisi dokusunda myogenin organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Önceki çalışmalar yoğun, 11-20 hedef gen düzenleyici dizilerinin ilgili kısmı kodlama in vitro tercüme veya bakteriyel myogenin ve radyoaktif DNA kullanan in vitro jel vardiya deneylerde ilk başlayan, dizileri içeren E kutusuna bağlayıcı myogenin belirlemiştir . Konvansiyonel C…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma 2009 yılı Amerikan Kurtarma ve yeniden yatırım Yasası ile verilen fonların ANI R01 GM56244 NIH tarafından desteklenen ve NIH R01 GM87130 JARP
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |