Summary
Wir zeigen die Metallierung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoid-Komplexen. Die hier beschriebenen Komplexe können konjugiert werden, um Makromoleküle, damit diese Rückverfolgung Moleküle mittels Magnetresonanztomographie.
Abstract
Polyaminopolycarboxylate-Liganden werden häufig verwendet, um Lanthanidionen Chelat, und die resultierenden Komplexe eignen sich als Kontrastmittel für die Kernspintomographie (MRI). Viele im Handel erhältliche Liganden sind besonders nützlich, da sie funktionelle Gruppen, die für schnelle, hochreine ermöglichen, und mit hoher Ausbeute Konjugation an Makromolekülen und Biomolekülen über aminreaktiven aktivierten Estern und Isothiocyanat-Gruppen oder Thiol-reaktive Maleinimide enthalten. Während Metallierung dieser Liganden wird als allgemein bekannt, im Bereich der Biokonjugation Chemie, subtile Unterschiede in Metallierung Verfahren müssen berücksichtigt werden bei der Auswahl Metall Ausgangsstoffe. Darüber hinaus mehrere Optionen für die Reinigung und Charakterisierung existieren, und die Auswahl der effektivsten Verfahren teilweise abhängig von der Auswahl der Ausgangsstoffe. Diese feinen Unterschiede sind oft in veröffentlichten Protokollen vernachlässigt. Hier ist es unser Ziel, gemeinsame Methoden für die Metallierung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoid-Komplexe, die als Kontrastmittel für die MRT (Abb. 1) verwendet werden können demonstrieren. Wir erwarten, dass diese Publikation ermöglicht biomedizinische Wissenschaftler Lanthanoid Komplexierung Reaktionen in ihr Repertoire von häufig verwendeten Reaktionen integrieren durch Lockerung der Auswahl der Ausgangsstoffe und Reinigungsverfahren.
Protocol
1. Metallierung mit LnCl 3 Salze
- Lösen des Liganden in Wasser zu einer Lösung von 30-265 mm. Die Liganden 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-Diethylentriaminpentaessigsäure (p-SCN-Bn-DTPA) wurde in diesem Video bei einer Konzentration von 73 mM verwendet.
- Den pH-Wert der Lösung von Ligand zwischen 5,5 und 7,0 durch Zugabe von 1 M NH 4 OH. In diesem Video wurden 0,2 ml der 1 M NH 4 OH-Lösung verwendet.
- Lösen Sie 1-2 Äquivalente der LnCl 3 in Wasser zu einer Lösung mit einer Konzentration von 5-1000 mm herzustellen. In diesem Video wurden EuCl 3 und GdCl 3 in Konzentrationen von 111 mM verwendet. Ein Überschuss an Metall wird häufig verwendet, um die Metallierung zum Abschluss zu bringen und damit zu vereinfachen Reinigung.
- Fügen Sie die Lösung von LnCl 3 zur Lösung des Liganden unter Rühren.
- Nach der Zugabe von LnCl 3, den pH-Wert der resultierenden Reaktionsmischung auf zwischen 5,5 und 7,0 durch Zugabe von 0,2 M NH 4 OH. Insgesamt 0,5 ml der 0,2 M NH 4 OH-Lösung wurde in diesem Video verwendet. Wenn Ihr Liganden enthält säureempfindlichen funktionellen Gruppen, den pH-Wert mehrmals während dieses Schrittes. ACHTUNG - Wird die Lösung zu einfach, jede Basis sensitive funktionelle Gruppen, wie Isothiocyanat wird unbrauchbar für die Konjugation werden.
- Überwachen Sie die Reaktion über pH-Messungen. Die Reaktion ist beendet, wenn der pH-Wert konstant bleibt.
2. Raising pH Aufarbeitung (nicht in diesem Video enthalten, aber gut für Liganden ohne Sockel-sensitive funktionelle Gruppen)
- Fügen Sie konzentrierte NH 4 OH auf die Reaktionsmischung auf pH-Wert von ≥ 11 einzustellen. Dieser Schritt wird jeder Niederschlag unkomplexierten Metall als unlösliches Hydroxid.
- Den Überstand durch einen 0,2 um Filter. Wenn die Reaktionsmischung verstopft den Filter, Zentrifugieren und Dekantieren vor dem Filtern wird empfohlen.
- Wenn eine Dialyse nicht durchgeführt werden, entfernen Sie unter vermindertem Druck (Rotationsverdampfer oder Gefriertrocknung wird empfohlen) Lösungsmittel.
- Steps 2,1-2,3 kann wiederholt werden, wenn freie Lanthanoid bleibt.
3. Dialyse Aufarbeitung
- Schneiden Sie den Dialyseschlauch auf eine geeignete Länge (folgen Sie den Richtlinien des Herstellers), um das Probenvolumen zu halten, während verlassen Überlänge (ca. 10% des Probenvolumens). In diesem Video wurde eine 100-500 Dalton Molekulargewicht cut-off (MWCO) Membran verwendet, aber auch größere MWCO Schlauch kann nach Bedarf verwendet werden, wenn Konjugation ist vor Metallierung durchgeführt. Außerdem können Dialyse-Kassetten als Alternative zum Dialyseschlauch wenn gewünscht verwendet werden.
- Gegebenenfalls basierend auf den Richtlinien des Herstellers, genießen den Schnitt Dialyseschlauch in Wasser 15 min bei Raumtemperatur.
- Füllen Sie ein Dialyse-Reservoir (a 1 L Becherglas wurde in diesem Video verwendet wird) mit Wasser (Dialysat). Das Dialysat Volumen sollte ca. 100x, dass der Probe sein.
- Falten Sie das eine Ende des Schlauchs zweimal und sichern Sie den gefalteten Teil des Schlauches mit einer Dialyse Verschluss spannen. Wickeln Sie das Ende des Verschlusses mit einem Gummiband um sicherzustellen, dass es während der Dialyse bleibt geschlossen.
- Filter das Reaktionsgemisch durch einen 0,2 um Filter, und laden Sie das Filtrat in das offene Ende des Schlauches darauf achten, daß die Schläuche zerreißen. Achten Sie darauf, genügend Kopfraum zu verlassen, um den Schlauch zu schließen.
- Falten Sie die verbleibenden offenen Ende des Rohres zweimal mit einem Verschluss zu sichern, und wickeln Sie den Verschluss mit einem Gummiband wie in Schritt 3.4.
- Bringen Sie ein Glasfläschchen mit Luft, um die Klemme an einem Ende der Dialyseschlauch mit einem Gummiband. Bringen Sie ein Fläschchen mit Sand auf die andere Klemme. Diese Fläschchen sicher, dass der Schlauch in das Dialysat bleibt eingetaucht.
- Stellen Sie den vollen Rohren in der Dialyse-Reservoir, das Dialysat enthält.
- Stir das Dialysat mit einer magnetischen Rührplatte mit langsamer Geschwindigkeit (kein Vortex) bei Raumtemperatur.
- Ändern Sie den Dialysat 3x im Laufe eines Tages (in diesem Video, das Dialysat wurde mit 2,5, 6,5 und 11,5 h geändert), und dann lassen Dialyse weiterhin über Nacht (für insgesamt von 20-28 h Dialyse).
- Entfernen Sie den Dialyseschlauch aus dem Dialysat und vorsichtig öffnen Sie eine Schließung auf die Probe zu entfernen. Waschen Sie den Dialyseschlauch 3x mit Wasser und kombinieren das Waschwasser mit der Probe.
- Entfernen Sie das Wasser unter vermindertem Druck. Bei der Gefriertrocknung wird in diesem Video verwendet.
4. Bewertung der Anwesenheit von freiem Metall
- Lösen Sie die Metall-Komplex in Acetatpuffer (Puffer Zubereitung: Lösen Sie 1,4 ml Essigsäure in 400 ml Wasser, den pH-Wert auf 5,8 mit 1 M NH 4 OH, und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 500 mL produzieren) und fügen Sie die Xylenol orange Anzeige (16 uM in pH 5,8-Puffer). In diesem Video, betrug 0,3 mg Komplex in 0,3 ml Puffer gelöst und 3 ml Indikator-Lösung versetzt.
- Das Vorhandensein von freiem Metall durch Beobachtung einer Farbänderung des Indikators von gelb bis violett.
- Falls gewünscht, kann die Menge des freien Metall durch die Schaffung einer Kalibrierkurve 1 quantifiziert werden. Alternativ kann der Farbstoff Arsenazo III statt Xylenolorange 2 verwendet werden. Wenn freies Metall bleibt, sollte die Probe weiter gereinigt werden mittels Dialyse, ein Entsalzungssäule oder High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) vor Charakterisierung.
5. Bestimmung der Wasser-Koordinationszahl (q)
- Bereiten Sie eine Lösung der Eu III-haltigen Komplex (~ 1 mm) in H 2 O und eine andere Lösung der gleichen Konzentration in D 2 O. Vor der Analyse muss die D 2 O-Lösung verdampft und gelöst in D 2 O dreimal um das restliche H 2 O. entfernen
- Fügen Sie die Wasser-Lösung, um eine saubere Küvette, und setzen Sie die Küvette in einem Spektrofluorometer.
- Führen Anregungs-und Emissions-Scans, um die Maxima für jede (~ 395 nm und ~ 595 nm, jeweils) zu bestimmen.
- Führen Sie eine Phosphoreszenz Zeit-Zerfall Experiment mit folgenden Parametern: Anregungs-und Emissionswellenlänge von Schritt 5.3, Anregung und Emission Spaltbreiten (5 nm), Flash-count (100), anfängliche Verzögerung (0,01 ms), maximale Verzögerung (13 ms) bestimmt und Verzögerungsinkrement (0,1 ms). Diese Bedingungen sind für die meisten Komplexe, aber die maximale Verzögerung und den inkrementellen Werten kann erhöht oder verringert werden für Arten mit sehr langen oder sehr kurzen Abklingzeiten.
- Wiederholen Sie Schritt 5.4 mit der D 2 O-Lösung in Schritt 5.1 vorbereitet.
- Von der Lumineszenz-Zerfall Daten in 5,4 und 5,5 erhalten, Grundstück den natürlichen Logarithmus der Intensität als Funktion der Zeit. Die Steigung dieser Geraden sind die Abbauraten (τ -1) (Abbildung 2). In diesem Video wurde Microsoft Excel 2007 verwendet werden, um den natürlichen Logarithmus Plots aus den Rohdaten zu generieren. Verwenden Sie die Abbauraten in der Gleichung von Horrocks und Mitarbeiter (eq 1) 3 entwickelt. Wenn Ihr Liganden enthält OH-oder NH-Gruppen koordiniert, um das Metall, dann ist die Gleichung müssen vor Gebrauch 3 geändert werden.
eq 1: 
6. Relaxivität Messungen
- Wählen Sie die gewünschte Anwendung Modus auf die Relaxationszeit Analysator: T 1 (longitudinale Relaxationszeit) oder T 2 (transversale Relaxationszeit).
- Eine Reihe von Proben, die verschiedene Konzentrationen von Gd III-haltigen Komplex in einem wässrigen Lösungsmittel enthalten. In diesem Video wurde Wasser als Lösungsmittel und Lösungen von 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 verwendet, und 0 mM hergestellt wurden. Andere wässrigen Lösungsmitteln oder Puffer könnte verwendet werden, aber es ist wichtig, um das Lösungsmittel als Blindwert verwendet. Das endgültige Volumen der Probe ist spezifisch für das Instrument, das verwendet wird.
- Legen Sie eine Probe in das Instrument und lassen es 5 min stehen lassen, um die Temperatur des Gerätes (37 ° C in diesem Video) ausgleichen.
- Bestimmen Sie die Relaxationszeit (in Einheiten von s) durch Anpassung der Parameter der Software, um einen reibungslosen exponentiellen Kurve für T 1 oder T 2 (repräsentative Kurven für T 1 und T 2 sind in Abbildung 3 dargestellt) zu erhalten.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.3 und 6.4 für alle Proben, einschließlich der leeren.
- Berechnen Sie die inverse der gemessenen T 1 oder T 2-Werte in Einheiten von s -1.
- Zeichnen Sie die T 1 -1 oder T 2 -1 Werte im Vergleich zu Gd III-Konzentration (in Einheiten von mM). Wegen der hygroskopischen Natur der Gd III-Komplexe, bestätigen die Konzentration von Gd III mit Atomabsorptionsspektrometrie oder induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie. Fit das Grundstück mit einer geraden Linie. Ein Vertreter Grundstück ist in Abbildung 4 dargestellt.
- Die Steigung der angepassten Linie ist die Relaxivität (r 1 oder r 2 für T 1 und T 2), gegliedert und verfügt über Einheiten mM -1 s -1.
7. Repräsentative Ergebnisse
Repräsentative Daten für die Schritte in diesem Protokoll sind in den Tabellen und Abbildungen Abschnitt aufgenommen worden. Neben der Wasser-Koordinationszahl und Relaxivität Charakterisierung in das Protokoll beschrieben, ist es wichtig, Endprodukte mit Standard-chemischen Verfahren zu charakterisieren. Die Identität der Verbindung kann mithilfe der Massenspektrometrie und Vertreter Massenspektren zeigen die diagnostischen Isotopenmuster für Gd III - und Eu III-haltige Komplexe sind in Abbildung 5 dargestellt. Darüber hinaus, für Nicht-Gd III
Abbildung 1 Allgemeine Regelung für die Metallierung und Reinigung:. Scheme Darstellung der allgemeinen Vorschrift zur Metallierung und Gründe für die Wahl verschiedener Reinigungsverfahren Routen.
Abbildung 2 Lumineszenz-Intensität Grundstück:. Representative Auftragung des natürlichen Logarithmus der Intensität als Funktion der Zeit aus Abschnitt 5. Die Steigungen der Linien von ähnlichen Kurven für Wasser-und D 2 O-Lösungen erworben generiert werden mit eq 1 verwendet, um das Wasser-Koordination Reihe von EU-III-haltige Komplexe zu charakterisieren.
Abbildung 3 Entspannung Abklingzeit Kurven:. Repräsentative Daten für (links) T 1 und (rechts) T 2 Erwerb. Abweichungen von diesen Kurvenformen erzeugen würde unzuverlässige Daten.
Abbildung 4 Relaxivität Bestimmung:. Ein Vertreter Auftragung von 1 / T 1 gegen die Konzentration von Gd III. Die Steigung der angepassten Linie ist Relaxivität und hat Einheiten mM -1 s -1.
Abbildung 5 Massenspektren:. Representative Massenspektren zeigen die diagnostischen Isotopenmuster für (links) Gd III-haltige Komplexe und (rechts) Eu III-haltige Komplexe. Der schwarze Gaussian Spitzen geben die theoretischen Isotopenverteilung und die roten Linien sind die eigentlichen Daten.
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Discussion
Angesichts der zunehmenden Zahl von Publikationen, die Lanthanoid-basierte Kontrastmittel 4-14 zählen, ist es wichtig, dass Pflege in der Vorbereitung, Reinigung und Charakterisierung von Produkten, um reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse zu gewährleisten, wird übernommen. Diese Komplexe werden oft als schwierig zu reinigen und zu charakterisieren gegenüber organischen Molekülen aufgrund ihrer paramagnetischen Natur und die Empfindlichkeit eines funktionellen Gruppen, die für Biokonjugation verwendet werden könnten. Wir haben gemeinsame Methoden für die Synthese, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanidkomplexe beschrieben. Doch bei der Wahl einer dieser Methoden ist es wichtig, die spezifischen System untersucht betrachten.
In Komplexierung Reaktionen kann eine Vielzahl von Metallsalzen, die kommerziell verfügbar sind verwendet werden, und die Auswahl des Salzes hängt vom Ziel der Studie. Zum Beispiel, ist ein Vorteil der Verwendung der Chlorid (oder Triflat oder Nitrat) Salze, die relativ milden Bedingungen bezüglich der Temperatur erforderlich sind. Allerdings erfordern diese Verfahren eine sorgfältige Überwachung des pH-Wertes und produzieren Salze als Nebenprodukte. Wenn das System untersucht wird besonders empfindlich auf Veränderungen des pH-Wertes, dann eine sorgfältige Überwachung und Steuerung des pH-Wertes durchgeführt werden müssen. Auch, wenn das Salz Nebenprodukte würde sich nachteilig auf das System untersucht, müssen sie entfernt werden, oder eine alternative Synthese verwendet werden. Mit der Lanthanoid-Hydroxid (oder Oxid) Ausgangsmaterialien, muss mit höheren Temperaturen wegen der geringen Löslichkeit dieser Spezies verwendet werden, aber das einzige Nebenprodukt der Metallierung ist das Wasser. Diese Methode ist ideal für Reaktionen, die schwer zu entsalzen würde, aber es wäre nicht für Temperatur-empfindlichen Systemen arbeiten. Es ist auch erwähnenswert, dass diese Metallierungen äußerst robust in Bezug auf die Konzentration von Metall und Ligand sind. Die Konzentrationsbereiche in Teil eine Spanne im Bereich von Konzentrationen, die wir in der Literatur finden konnte.
Neben nachdenklich Auswahl aus Metall Ausgangsmaterial, ist es wichtig zu betonen, dass sowohl das Metall und Ligand wahrscheinlich in enger Beziehung Wasser und Lösungsmittel-Molekülen, selbst wenn sie zu trocken erscheinen. Diese zusätzlichen Moleküle sind oft genug, um stark verzerren die Stöchiometrie der Reaktion. Daher ist es hilfreich, gut charakterisiert Ausgangsstoffe (Elementaranalyse), so dass genaue Mengen dieser Materialien in die Reaktion eingesetzt werden können.
In diesem Artikel, betonen wir die Bedeutung der Beibehaltung der pH-Wert des Reaktionsgemisches. Diese pH-Kontrolle ist von entscheidender Bedeutung, da mehrere Aspekte der Reaktion, die fehlschlagen, wenn der pH-Wert darf aus der Nähe von neutral abweichen können. Für die Metallierung zu kommen, muss der Carbonsäuren auf die Liganden deprotoniert (nahe neutral oder höher pH-Wert), während die Lanthanoidion müssen bleiben löslich (bei neutralen oder niedrigeren pH-Wert). Wenn der pH-Wert zu hoch ist, wird unlösliches Hydroxid-Komplexe der Lanthanoidion Niederschlag und die Reaktion anzuhalten. Alternativ, wenn der pH-Wert zu niedrig ist, werden die Carbonsäuren bleiben protonierten und der Ligand nicht an das Metall koordinieren. Außerdem bei extremen pH-Werten, werden reaktive funktionelle Gruppen zerfallen und machen die komplexe inert gegenüber nachfolgenden Biokonjugationsreaktionen. Um die Sache noch komplizierter, als die Metallierung Reaktion auftritt, ist der pH-Wert der Reaktionsmischung abgesenkt als die Carbonsäuren deprotoniert sind. Während die pH Balance-Akt der Metallierung erscheinen mag, kann sie auch problemlos mit vorsichtige Zugabe von Base kontrolliert werden.
Es gibt viele Strategien zur Metallierung mit feinen Unterschiede. In diesem Artikel werden wir beschlossen, die Verwendung von überschüssigen Metalls zu beschreiben. Es ist auch akzeptabel, um überschüssige Ligand oder äquivalenter Mengen von Ligand und Metall (bezogen auf elementares Analyse der Ausgangsstoffe) zu verwenden. Es gibt Vorteile und Nachteile der einzelnen Strecke. Der Hauptvorteil der Verwendung von überschüssigem Metall ist, dass die Liganden ist oft die teuerste Ausgangsmaterial, und diese Methode kann Geld sparen. Allerdings, wenn Metall im Überschuss eingesetzt wird, ist die Entfernung des überschüssigen Metalls von entscheidender Bedeutung, da jede freie Metall dramatisch beeinflussen können wichtige Eigenschaften wie Relaxivität und Toxizität. Wenn Dialyse gegen Wasser nicht ausreicht, um überschüssige Metall, Dialyse gegen Citratpuffer entfernen können durchgeführt durch Dialyse mit Wasser zu Citratpuffer entfernen befolgt werden. Alternativ kann ein Entsalzungssäule oder HPLC wie verwendet werden, solange darauf geachtet wird, dass pH-Neutralität der mobilen Phase wird verwendet, zu gewährleisten. Als Ligand im Überschuss eingesetzt wird, gibt es nicht mehr die dringende Notwendigkeit, überschüssiges Metall und überschüssige Liganden zu entfernen wird wahrscheinlich keinen Einfluss auf Relaxivität, aber freier Ligand bleiben. Für die anschließende Biokonjugationsreaktionen, kann diese überschüssige Ligand problematisch und führen zu inhomogenen Konjugate, die nur schwer zu trennen sind. Um dieses Problem, Metall comp Abhilfelext kann aus wasserfreiem Diethylether oder HPLC kann verwendet werden, um Metall-Komplex von überschüssigem Liganden getrennt werden ausgefällt werden. Im Idealfall würde Ligand und Metall in einem Verhältnis von 1:1 führt keine Metall-oder Liganden-basierte Nebenprodukte eingesetzt werden. Allerdings ist Elementaranalyse für beide Ausgangsstoffe vor jeder Reaktion benötigt wird, und wenn es eine leichte Abweichung von einer 1:1-Ligand-Metall-Verhältnis, dann wird die Reaktion entweder in Fall der Ligand-in-Mehr-oder Metall- in-Überschuss Kategorien, die daraus resultierende Notwendigkeit zur Reinigung.
Wir haben Metallierung gezeigt, wo der entstehende Komplex ist bereit für Biokonjugation 15-17. Eine Alternative zu dieser Strategie ist die Konjugation von Ligand und Biomolekül zunächst durch Metallierung 18,19 gefolgt. Mit diesem Konjugat-then-metallats Strategie müssen die gleichen Faktoren, die berücksichtigt werden, wenn der Entscheidung über eine Metallierung Route (pH-Empfindlichkeit und Temperaturempfindlichkeit der Biomolekül sowie die Fähigkeit, Produkte aus Salzen zu reinigen).
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Anschubfinanzierung von der Wayne State University (MJA), einen Zuschuss von der American Foundation for Aging Research (SMV) und ein Pathway to Independence Career Transition Award (R00EB007129) aus dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering der National Institutes of Health (MJA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EuCl3∙6H2O | Sigma-Aldrich | 203254-5G | |
| p-SCN-Bn-DTPA | Macrocyclics | B-305 | |
| ammonium hydroxide | EMD Millipore | AX1303-3 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester (CE) Dialysis Membrane - 500 D MWCO | Fisher Scientific | 68-671-24 | |
| Millipore IC Millex-LG Filter Units | Fisher Scientific | SLLG C13 NL | |
| xylenol orange tetrasodium salt | Alfa Aesar | 41379 | |
| acetic acid | Fluka | 49199 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-4-25 | |
| water purifier | ELGA | Purelab Ultra | |
| high performance liquid chromatography and mass spectrometry | Shimadzu Corporation | LCMS-2010EV | |
| relaxation time analyzer | Bruker Corporation | mq60 minispec | |
| UV-vis spectrophotometer | Fisher Scientific | 20-624-00092 | |
| freeze dryer | Fisher Scientific | 10-030-133 | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI 221 | |
| spectrofluorometer | Horiba Instruments Inc | Fluoromax-4 | |
| Molecular Weight Calculator version 6.46 by Matthew Monr–, downloaded October 17, 2009 |  http://ncrr.pnl.gov/software/ |
Molecular Weight Calculator |
References
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