Isolement des cellules immunitaires fonctionnelles cardiaques

Summary

Cette méthode pour isoler les cellules immunitaires fonctionnelles du cœur offre une alternative aux méthodes classiques de digestion à la collagénase, ce qui provoque l'activation des cellules immunitaires indésirables, résultant en une diminution de la réactivité de ces cellules. Notre méthode d'isolement des rendements fonctionnelle cardiaque des cellules immunitaires en évitant les problèmes liés à la digestion enzymatique.

Abstract

Cardiaque des cellules immunitaires sont de plus d'intérêt pour les rôles qu'ils jouent dans le remodelage pathologique dans de nombreuses maladies cardiaques ^1-5 Ces cellules immunitaires, qui comprennent les mastocytes, les cellules T et les macrophages;. Stocker et libérer une variété de médiateurs biologiquement actifs incluant des cytokines et des protéases telles que la tryptase ^6-8. Ces médiateurs ont été montré à être des acteurs clé dans le métabolisme de la matrice extracellulaire par l'activation de métalloprotéases matricielles ou de causer une accumulation de collagène par les fibroblastes de moduler la fonction cardiaque ". ^9-11 Cependant, les techniques disponibles pour isoler les cellules immunitaires ont cardiaques été problématique, car ils utilisent la collagénase bactérienne à digérer le tissu myocardique. Cette technique provoque une activation des cellules immunitaires et donc une perte de fonction. Par exemple, les mastocytes cardiaques deviennent beaucoup moins sensibles aux composés qui causent la dégranulation. ^{12 C'est} pourquoi, nous avons développé une technique qui permet de tIl isolement des cellules immunitaires fonctionnelles cardiaques qui conduirait à une meilleure compréhension du rôle de ces cellules dans la maladie cardiaque. ^{13, 14}

Cette méthode requiert une certaine familiarité avec la localisation anatomique de la xiphoïde du rat processus, l'aisselle et ligament falciforme, et le péricarde du cœur. Ces repères sont importants pour accroître la réussite de la procédure et d'assurer un rendement plus élevé de cellules immunitaires cardiaques. Ces cellules immunitaires isolés cardiaques peuvent alors être utilisées pour la caractérisation de fonctionnalité, de phénotype, de maturité et de co-culture des expériences avec d'autres cellules cardiaques d'acquérir une meilleure compréhension de leurs interactions.

Protocol

1. Préparation de la solution de Hanks équilibre salin (HBSS) Autoclave 1 bécher L, 1000 ml graduée, et remuez-bar. Reconstituer la solution en poudre dans l'autoclave HBSS 1 bécher en verre L pour la marque 900 ml d'eau bidistillée. Mélanger une solution HBSS avec 3,4 g de Hepes Na + sel et ajuster le pH à une valeur comprise entre 7,35 à 7,41 en utilisant soit concentrée HCl ou NaOH. Une fois le pH souhaité a été atteint et reste stable, ajouter 5 g de sér…

Discussion

Cette méthode d'isolement de cellules immunitaires cardiaques permet l'analyse de leur fonction, le phénotype et la maturité sans l'activation non désirée qui se produit généralement lors d'une technique traditionnelle digestion enzymatique isolement. Le nombre total moyen de cellules obtenues avec cette technique est d'environ 400.000 par cœur de rat, et une coloration différentielle et d'analyse de cytométrie en flux de ces cellules indique population mixte de lymphocytes T (~ 70%), l…

Materials

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Products	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE Incorporated	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483