Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

Summary

Este método para aislar células del sistema inmune funcional del corazón es una alternativa a los métodos convencionales de digestión de colagenasa, que provoca la activación de células inmunes no deseadas, lo que resulta en una disminución de la respuesta de estas células. Nuestro método de aislamiento de los rendimientos de las células inmunes funcional cardiaca, evitando los problemas asociados con la digestión enzimática.

Abstract

Cardiaco las células inmunes están ganando interés por el papel que desempeñan en el remodelado patológico de muchas enfermedades cardíacas ^1-5 Estas células inmunes, que incluyen los mastocitos, las células T y los macrófagos,. Almacenar y liberar una variedad de mediadores biológicamente activos, incluyendo citoquinas y proteasas como la triptasa. ^6-8 Estos mediadores han demostrado ser jugadores clave en el metabolismo de la matriz extracelular mediante la activación de metaloproteinasas de la matriz o causar la acumulación de colágeno mediante la modulación de la función de los fibroblastos cardíacos. ^9-11 Sin embargo, las técnicas disponibles para el aislamiento de las células inmunes tienen cardiaca sido problemático debido a que utilizan la colagenasa bacteriana para digerir el tejido miocárdico. Esta técnica provoca la activación de las células del sistema inmune y por lo tanto una pérdida de la función. Por ejemplo, los mastocitos se cardiaca significativamente menos sensibles a los compuestos que causan la degranulación. ¹² Por tanto, hemos desarrollado una técnica que permite taislamiento de las células cardiacas funcionales inmune que daría lugar a una mejor comprensión del papel de estas células en la enfermedad cardíaca que. ^{13, 14}

Este método requiere una familiaridad con la localización anatómica de xifoides de la rata proceso, la axila y el ligamento falciforme, y el pericardio del corazón. Estas señales son importantes para aumentar el éxito del procedimiento y para asegurar un mayor rendimiento cardíaco de células inmunes. Estas células inmunes aisladas cardíaco puede ser utilizado para la caracterización de la funcionalidad, el fenotipo, la madurez y la cultura co-experimentos con otras células cardíacas para obtener una mejor comprensión de sus interacciones.

Protocol

1. Preparación de la solución de Hanks balance de sal (HBSS) Autoclave un vaso de vidrio L, 1000 ml cilindro graduado, y una barra de agitación. Reconstituir la solución en polvo HBSS en el autoclave un vaso de vidrio L hasta la marca de 900 ml con agua destilada. Mezcle la solución HBSS con 3,4 g de sal de Na + Hepes y ajustar el pH a un valor entre 7.35 a 7.41 utilizando HCl concentrado o NaOH. Una vez que el pH deseado se ha alcanzado y se mantiene estable, añadir 5 g de…

Discussion

Este método de aislamiento de las células inmunes cardíaco permite el análisis de su función, el fenotipo, y su vencimiento sin que la activación no deseada que se produce normalmente durante la tradicional técnica enzimática aislamiento digestión. La media del número total de células que se obtienen con esta técnica es de alrededor de 400.000 por el corazón de rata, y tinción diferencial y el análisis de citometría de flujo de estas células indica población mixta de linfocitos T (~ 70%), los macrófag…

Materials

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Products	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE Incorporated	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483