Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen
Summary
Wir beschreiben eine Reihe von Tests zur Expression von H1 Linker Histonen zu analysieren. mRNA einzelner Gene H1 werden quantitativ durch zufällige Primer basieren reverse Transkription durch real-time PCR gefolgt gemessen, während Protein Quantifizierung der H1-Histone durch HPLC-Analyse erreicht wird.
Abstract
Histon H1 bindet an den Nukleosomen Kernteilchen und Linker-DNA, die Erleichterung Faltung von Chromatin in Struktur höherer Ordnung. H1 ist für Säugetier-Entwicklung ein wesentlicher und reguliert die Genexpression in vivo 2-4. Unter den hoch konservierte Histon-Proteine ist die Familie von H1 Linker Histonen die heterogene Gruppe. Es gibt 11 H1-Subtypen bei Säugetieren, die differentiell während der Entwicklung und in verschiedenen Zelltypen geregelt sind. Diese H1 Subtypen umfassen 5 somatischen H1s (H1a-e), der Ersatz H1 0, 4 Keimzellen spezifische H1 Subtypen und H1x 5. Das Vorhandensein von mehreren H1 Subtypen, die DNA-Bindungsaffinität und Chromatin Verdichtung Fähigkeit unterscheiden 6-9 bietet eine zusätzliche Modulation der Chromatinstruktur Funktion. Somit ist die quantitative Analyse der Expression einzelnen H1 Subtypen, sowohl von mRNA und Proteinen, zum besseren Verständnis der Regulation der höheren erforderlichenchromosomaler Struktur und Funktion.
Hier beschreiben wir eine Reihe von Tests zur Analyse der Expression von einzelnen H1 Subtypen (1) ausgebildet ist. mRNA-Expression von verschiedenen Genen H1 Variante wird durch eine Reihe von hochempfindlichen und quantitative RT-PCR (qRT-PCR)-Assays, die schneller, genauer und erfordern viel weniger Proben im Vergleich zu der alternativen Ansatz der Northern-Blot-Analyse gemessen. Anders als die meisten anderen zellulären mRNA-Einträge, fehlt mRNAs für die meisten Histone, einschließlich der Mehrheit der Gene H1, eine lange polyA-Schwanz, aber auch eine Stamm-Schleifen-Struktur am 3'-untranslatierten Region (UTR) 10. Daher werden cDNAs aus Gesamt-RNA durch reverse Transkription unter Verwendung von Zufallsprimern statt Oligo-dT-Primer hergestellt. Echtzeit PCR mit Primern, die an jedem H1 Subtypen (Tabelle 1) werden durchgeführt, um eine möglichst quantitative Messung der mRNA-Spiegel von einzelnen H1-Subtyp zu erhaltens. Die Expression von Housekeeping-Gene werden als Steuerelemente für Normalisierung analysiert.
Die relative Häufigkeit der Proteine des H1-Subtyp und Histone wird durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC)-Analyse von Gesamt Histone aus Säugerzellen 11-13 extrahiert wurde. Die HPLC-Methode und Elution hier beschriebenen Bedingungen geben optimale Trennungen von Maus H1-Subtypen. Durch die Quantifizierung der HPLC-Profil, berechnen wir den relativen Anteil der einzelnen Subtypen H1 H1 innerhalb der Familie, sowie Bestimmung der H1 um Nukleosomen-Verhältnis in den Zellen.
Protocol
Discussion
Die Menge der hier vorgestellten Assays ermöglichen eine umfassende Analyse der Expression von Säugetier-Histon-Subtypen. Sorgfältig geplante und qRT-PCR-Assays bieten hochempfindliche und genaue Messungen der RNA-Nachrichten von Säugetier-Histon H1-Gene. Der kritische Teil qRT-PCR-Assays für Histon-Subtyp Gene ist die Herstellung von cDNA unter Verwendung von zufälligen Primers Reverse Transkription. mRNA der meisten Histone, einschließlich der meisten Gene H1, enthalten keine langen Poly-A-Schwanz in anderen ze…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch NIH GM085261 und ein Georgien Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (zu YF) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
Referencias
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