Препарирование взрослых маточки мыши и аденовирус-опосредованный опорно-клетки инфекции
Summary
Mechanosensory волосковых клеток рецепторных клеток внутреннего уха. Наиболее характерны<em> В пробирке</em> Модель системы зрелые клетки млекопитающих волосы использует орган культур Мешочки из взрослых мышей. Мы представляем вскрытии взрослого маточки мыши, и мы демонстрируем аденовирус-опосредованной инфекции опорных клеток в культуре Мешочки.
Abstract
Потеря слуха и равновесия нарушения часто бывают вызваны смертью mechanosensory волосковых клеток, которые являются рецепторных клеток внутреннего уха. Поскольку не существует клеточная линия, удовлетворительно представляет клетках млекопитающих волосы, исследование волосковых клеток основывается на первичных культурах органа. Наиболее характерны в пробирке модель системы зрелые клетки млекопитающих волосы использует орган культур Мешочки из взрослых мышей (рис. 1) 1-6. Мешочке находится вестибулярный орган и волосковых клеток утрикулюса схожи по структуре и функции волосковых клеток слухового органа, органа Корти. Маточки взрослой мыши Препарат представляет собой зрелый сенсорного эпителия для изучения молекулярных сигналов, которые регулируют выживание, гомеостаз, и смерти этих клеток.
Млекопитающих кохлеарные волосковые клетки терминально дифференцированные и не восстанавливаются в случае их утраты. В не-маммалийских позвоночными, слуховой и вестибулярной гибели клеток волос сопровождается надежной регенерации, восстанавливает слуха и равновесия функций 7, 8. Регенерации волосковых клеток опосредуется глии, как поддерживающие клетки, которые контактируют с базальной поверхности волосковых клеток чувствительного эпителия 9, 10. Поддержка клетки также являются важными посредниками волос выживания и гибели клеток 11. Недавно мы разработали методику инфекции опорных клеток в культуре Мешочки использованием аденовируса. Использование аденовируса типа 5 (dE1/E3) для доставки трансгена содержащие GFP под контролем промотора CMV, мы обнаружили, что аденовирус конкретно и эффективно заражает опорных клеток. Поддержка эффективности ячейки инфекции составляет примерно 25-50%, а волосковые клетки не заражены (рис. 2). Важно отметить, что мы обнаружили, что аденовирусная инфекция опорных клеток не приводит к токсичности для волосковых клеток или поддерживающие клетки, а клеток в Ad-GFP инфected Мешочки эквивалентны тем, кто в неинфицированных Мешочки (рис. 3). Таким образом, аденовирус-опосредованной экспрессии генов в клетках поддержки культурных Мешочки предоставляет мощный инструмент для изучения роли опорных клеток в качестве посредников волос выживаемость клеток, смерть и возрождение.
Protocol
Discussion
Сенсорные волосковые клетки чувствительны к смерти от различных стрессов, включая старение, шум травмы, и воздействие ототоксичных наркотиков, в том числе аминогликозидов и противоопухолевое средство цисплатин. У млекопитающих волосы гибель клеток приводит к постоянной потере слуха…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Отделом Внутренние исследования в Национальном институте глухоты и других расстройств общения. Дополнительная поддержка была оказана NIDCD 5R01 DC007613.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
| DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
| Penicillin G | Sigma | P3032 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
| Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
| sodium borohydride | Sigma | 452882 |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
| Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.
Referencias
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate. J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).
- Ou, H. C. Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).
- Chiu, L. L. Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).
- Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death. Hear Res. , 221-221 (2006).
- Matsui, J. I., Cotanche, D. A. Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).
- Ryals, B. M., Rubel, E. W. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail. Science. 240, 1774-176 (1988).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240, 1772-174 (1988).
- Shang, J. Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).
- Lahne, M., Gale, J. E. Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium. J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).
- Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin. Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).
- Matsui, J. I. Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo. J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).
- Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).
- Nakagawa, T. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res. 176, 1-2 (2003).
- Forge, A., Li, L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res. 139, 1-2 (2000).
- Liu, W. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death. Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).
- Francis, S. P. Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32). Cell Death and Disease. , (2011).
- Wang, J. Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss. Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).
- Bird, J. E. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear. J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).
- Sato, E. Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).
