Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.
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Artículo de método
Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
En vivo de imágenes de la función cortical requiere acceso óptico hasta el cerebro, sin alteración del medio ambiente intracraneal. Se presenta un método para formar un cráneo pulido y reforzado con adelgazado (puertos) ventana en el cráneo del ratón que se extiende por varios milímetros de diámetro y se mantiene estable desde hace meses. El cráneo está adelgazada para 10 a 15 micras de espesor con un taladro de mano para lograr la claridad óptica, y después se cubrió con pegamento de cianoacrilato y una cubierta de vidrio para: 1) proporcionar rigidez, 2) inhibir la regeneración ósea y 3) reducir la dispersión de luz a partir de las irregularidades sobre la superficie del hueso. Dado que el cráneo no se rompe, la inflamación que puede afectar al proceso objeto de estudio se reduce considerablemente. Profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie cortical se puede lograr utilizando dos fotones de microscopía de barrido láser. Esta ventana se adapta bien para estudiar el flujo sanguíneo cerebral y la función celular en forma de preparados tanto anestesiados y despierto. Además, ofrece la optunidad para manipular la actividad de células utilizando optogenética o para interrumpir el flujo de sangre en los vasos dirigidos por irradiación de circulante fotosensibilizadores.
Protocolo
1. Preparativos para la operación i
- Limpiar los instrumentos quirúrgicos por tratamiento con ultrasonidos en una mezcla de leche Maxizyme y Quirúrgicas en un limpiador ultrasónico. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos antes de cada experimento.
- Asegúrese de que todos los reactivos necesarios y desechables están disponibles. Una lista de los reactivos y desechables se proporciona en la Tabla 2. Los reactivos y material desechable que entran en contacto con los tejidos expuestos deben ser estériles, cuando sea posible.
- Inducir la anestesia. Anestésicos típicos adecuados para estudios de supervivencia se describen en la Tab....
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Discusión
De dos fotones de imágenes a través de una ventana de los puertos exige la transmisión a través del hueso adelgazado y la duramadre, que atenúa la luz del láser, y añade las aberraciones ópticas a mayores profundidades 8. Sin embargo, a pesar de este inconveniente, las profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie pial se puede lograr con 900 nm de excitación. Mayores profundidades de imagen puede ser en principio posible con longitudes de onda de excitación más largos 13........
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Divulgaciones
No hay nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (beca posdoctoral de AYS) y los Institutos Nacionales de Salud (MH085499, EB003832 y OD006831 a DK). Damos las gracias a Bet Friedman y Blinder Pablo de comentarios sobre el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Agente | Ruta de la entrega | Dosis para el ratón | Duración | Notas | Fuente | Ref. Ref. |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 ug / g | 15-60 min | Estrecho margen de seguridad. Trabajar hasta una dosis adecuada de anestesia lentamente. Suplemento 10% de la dosis de inducción según sea necesario. | 036093; mayordomo Schein | 7 |
| La ketamina (Ketaset) mezclado con xilazina (Anased) | IP | 60 mg / g (K) 10 mg / g (X) (mezcla en la misma jeringa) | 20-30 min | Xilazina es co-inyectado como un relajante muscular y analgésico. Suplemento sólo ketamina a 50% de la dosis de inducción según sea necesario. | (K) 010 177, (X) 033 198; Butler, Schein | 7 |
| El isoflurano (Isothesia) | Inhalación | 4% de media de la concentración alveolar (MAC) para la inducción; 1.2% MAC para el mantenimiento | 4-6 h. | Siempre en mezcla de 70% de oxígeno y 30% de óxido nitroso. La anestesia prolongada conduce a la lenta recuperación. | 029403; mayordomo Schein | 26 |
Tabla 1. Sugerido agentes anestésicos para los estudios de supervivencia.
| TEMA | EMPRESA | Catálogo # / MODELO |
|---|---|---|
| Betadine | Butler, Schein | 6906950 |
| La buprenorfina (Buprenex) | Butler, Schein | 031919 |
| Isotiocianato de fluoresceína dextrano, 2 de peso molecular MDa | Sigma | FD2000S |
| El alcohol isopropílico | Pescador | AC42383-0010 |
| Solución de Ringer Lactato | Butler, Schein | 009846; |
| La lidocaína solución, 2% (v / v) | Butler, Schein | 002468 |
| Salina | Butler, Schein | 009861 |
| Leche quirúrgica | Butler, Schein | 014325 |
| Rojo Texas dextrano, 70 kDa de peso molecular | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler, Schein | 035646 |
| DESECHABLES | ||
| Carburo de rebabas, tamaño de la punta 2.1 mm | Herramientas de Bellas Ciencia | 19007-05 |
| Aplicadores cottoned punta | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Cubierta de vidrio, no. 0 espesor | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Pegamento de cianoacrilato | ND Industrias | 31428 H04308 |
| Gas plumero | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip polvo de cemento | Dentsply | 675571 |
| Grip cemento solvente | Dentsply | 675572 |
| Jeringa de insulina, 0,3 ml de volumen, con aguja de calibre 29,5 | Butler, Schein | 018384 |
| Tuerca y tornillo para asegurar la cabeza | Digikey | Nut, H723-ND, perno, R2-56X1/4-ND |
| Pomada oftálmica | Butler, Schein | 039886 |
| Las hojas de bisturí | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Tornillos, autorroscante # 000 | JI Morris Empresa | FF000CE125 |
| De silicona de acuario sellador | Perfecto Manufactura | 31001 |
| Polvo de óxido de estaño | Minerales de mamá | EQT-TINOX |
| EQUIPO | ||
| Vidrio escribano | Fisher Scientific | 08-675 |
| Microscopio de disección | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Taladro eléctrico alimentado | Foredom o Osada | K.1020 (Foredom) o EXL-M40 (Osada) |
| Maquinilla de afeitar eléctrica | Wahl | Serie 8900 |
| Pinzas, Dumont no. 55 | Herramientas de Bellas Ciencia | 11255-20 |
| Comentarios almohadilla de calor regulado | FHC | 40-90-8 (termistor rectal, 40-90-5D-02; hcomer almohadilla, 40-90-2-07) |
| Vaporizador de isoflurano | Ohmeda | IsoTec4 |
| Oxímetro de pulso | Starr Ciencias de la Vida | MouseOx |
| Destornillador en miniatura | Garret Wade | 26B09.01 |
| Marco estereotáxico | Kopf Instruments | Modelo 900 (con la máscara del ratón anestesia y no ruptura de las barras de las orejas) |
| Tijeras quirúrgicas, extremo romo | Herramientas de Bellas Ciencia | 14078-10 |
| Limpiador ultrasónico | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Tabla 2. Lista de los reactivos específicos, desechables y equipo.
Referencias
- Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex re....
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Reimpresiones y permisos
