Summary
يوصف بروتوكول الأساسية للانفصال شظايا من الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربائي.
Abstract
الاغاروز هلام إستشراد هو أنجع وسيلة للفصل بين شظايا من الحمض النووي من أحجام مختلفة تتراوح بين 100 شركة بريتيش بتروليوم إلى 25 كيلو بايت 1. معزول الاغاروز من الأعشاب البحرية Gelidium جنسا والجراسيلاريا، ويتكون من agarobiose المتكررة (L-D-والجالاكتوز) مفارز 2. خلال دبق، والبوليمرات الاغاروز ربط غير تساهمي وتشكيل شبكة من الحزم الذي المسام تحديد الأحجام جل والجزيئية خصائص النخل. ثورة في استخدام هلام إستشراد الاغاروز فصل الحمض النووي. وقبل اعتماد من المواد الهلامية الاغاروز، ويفصل في المقام الأول الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي السكروز التدرج الكثافة، والتي وفرت فقط تقريبي عن حجمها. لفصل الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربي، يتم تحميل الحمض النووي في سابقة الصب آبار في الهلام والتطبيقية الحالية. واتهم سلبا على العمود الفقري الفوسفات من الحمض النووي (RNA و) جزيء، وبالتالي عندما توضع في مجال كهربائي، وشظايا من الحمض النووي الهجرة إلى صاتهم ositively الأنود. لأن الحمض النووي لديه كتلة موحدة / المسؤول عن النسبة، يتم فصل جزيئات الحمض النووي من حيث الحجم داخل هلام الاغاروز في نمط من هذا القبيل أن المسافة المقطوعة تتناسب عكسيا إلى سجل من وزنه الجزيئي 3. و"منحاز reptation" النموذج الرائد للحركة الحمض النووي من خلال الجل الاغاروز، حيث الحافة الأمامية تتحرك إلى الأمام وتسحب بقية جزيء على طول 4. يتم تحديد معدل الهجرة من جزيء الحمض النووي من خلال مادة هلامية من قبل ما يلي: حجم 1) من جزيء الحمض النووي، 2) الاغاروز تركيز، 3) التشكل DNA 5، 4) الجهد التطبيقية، 5) وجود بروميد إيثيديوم، 6) نوع من عازلة الكهربائي الاغاروز و 7). بعد الانفصال، لا يمكن للجزيئات الحمض النووي يمكن تصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بعد تلطيخ مع صبغ المناسبة. باتباع هذا البروتوكول، يجب أن يكون الطالب قادرا على:
- فهم الآلية التي يتم فصل شظايا من الحمض النووي داخل مصفوفة هلام
- فهم كيفية التشكل للوجزيء الحمض النووي تحديد التنقل من خلال مصفوفة هلام
- التعرف على حل الاغاروز من تركيز مناسب لاحتياجاتهم
- إعداد هلام الاغاروز الكهربائي من لعينات من الحمض النووي
- إعداد الجهاز الكهربائي للهلام وامدادات الطاقة
- اختيار الجهد المناسب لانفصال شظايا من الحمض النووي
- فهم الآلية التي إيثيديوم بروميد يسمح التصور من عصابات الحمض النووي
- تحديد أحجام شظايا من الحمض النووي فصل
Protocol
1. إعداد جيل
- تزن خارج الكتلة المناسبة من الاغاروز الى دورق مخروطي. وتعد المواد الهلامية الاغاروز باستخدام AW / الخامس حل مئوية. سيكون تركيز الاغاروز في جل تعتمد على أحجام شظايا من الحمض النووي يمكن فصلها، مع معظم المواد الهلامية التي تتراوح بين 0.5٪ -2٪. وينبغي أن حجم المخزن المؤقت لا يكون أكبر من 1/3 من قدرة قارورة.
- إضافة إلى تشغيل العازلة القارورة التي تحتوي على الاغاروز. دوامة لخلط. الجل الأكثر شيوعا تشغيل مخازن هي تاي (40 ملم تريس، خلات، 1 ملم EDTA) وTBE (45 مم، تريس بورات، 1 ملم EDTA).
- يذوب الخليط الاغاروز / العازلة. هو الأكثر شيوعا ويتم ذلك عن طريق تسخين في الميكروويف، ولكن يمكن أيضا أن يتم على نار بنسن. على فترات ق 30، إزالة قارورة وعباب المحتويات إلى مزيج جيد. كرر حتى الاغاروز قد حلت تماما.
- إضافة إيثيديوم بروميد (EtBr) إلى تركيز 0.5 ميكروغرام / مل. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن جل ملطخة بعد الكهربائيةرحلان في تشغيل العازلة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل EtBr عن 15-30 دقيقة، تليها destaining في تشغيل المخزن المؤقت لمدة متساوية من الزمن.
ملاحظة: EtBr هو مادة مسرطنة مشتبه بهم، ويجب التخلص منها بطريقة صحيحة في لوائح المؤسسة. وينبغي دائما أن ترتديه قفازات عند التعامل مع المواد الهلامية التي تحتوي على EtBr. الأصباغ البديلة لتلطيخ من الحمض النووي متاحة، ومع ذلك لا يزال EtBr الأكثر شعبية واحدة نظرا لحساسيتها والتكلفة.
- السماح لتبريد الاغاروز إما على الفوق أو حضانة في حمام ماء 65 درجة مئوية. وعدم القيام بذلك تشوه علبة هلام.
- وضع علبة الجل في جهاز الصب. بدلا من ذلك، قد شريط واحد أيضا على حواف مفتوحة من علبة الجل لخلق القالب. تضع مشط المناسبة في القالب هلام لإنشاء الآبار.
- صب الاغاروز المنصهر في القالب الجل. السماح للالاغاروز لتعيين في درجة حرارة الغرفة. إزالة مشط ووضع الجل في المربع هلام. بدلا من ذلك، زويمكن أيضا أن تكون ملفوفة في شرم الاغطية البلاستيكية وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدام (الشكل 1).
2. إنشاء جهاز جل والفصل بين أجزاء الحمض النووي
- إضافة إلى تحميل صبغ عينات من الحمض النووي لا بد من فصل (الشكل 2). يتم عادة جل التحميل صبغ في تركيز 6X (0.25٪ برومفينول الزرقاء، 0.25٪ cyanol الزيلين، 30 الجلسرين٪). التحميل صبغ يساعد على تتبع مدى عينة الحمض النووي الخاص بك قد سافر، ويسمح أيضا العينة لتغرق في هلام.
- برنامج التيار الكهربائي إلى الجهد المطلوب (1-5V/cm بين الأقطاب الكهربائية).
- إضافة يكفي العازلة تشغيل لتغطية سطح هلام. من المهم لاستخدام المخزن المؤقت تشغيل نفسه بوصفها واحدة تستخدم لتحضير هلام.
- نعلق يؤدي من مربع هلام لامدادات الطاقة. بدوره على امدادات الطاقة والتحقق من أن كلا من صندوق جل وامدادات الطاقة والعمل.
- إزالة الغطاء. ببطءوتحميل بعناية عينة من الحمض النووي (ق) في هلام (الشكل 3). وينبغي دائما على حجم الحمض النووي مناسبة علامة يمكن تحميل جنبا إلى جنب مع نماذج تجريبية.
- استبدال غطاء لصندوق هلام. وينبغي أن الكاثود (الخيوط السوداء) تكون أقرب الآبار من (الخيوط الحمراء) الأنود. مضاعفة التحقق التي تم توصيل أقطاب كهربائية في فتحات الصحيح في امدادات الطاقة.
- بدوره على السلطة. تشغيل هلام حتى الصبغة قد هاجروا إلى مسافة مناسبة.
3. ملاحظة شظايا من الحمض النووي مطلق
- عندما أكملت الكهربائي، إيقاف تشغيل التيار الكهربائي وإزالة غطاء العلبة هلام.
- إزالة هلام من مربع هلام. تصريف فائض العازلة من على سطح الأرض من هلام. وضع علبة الجل على مناشف ورقية لامتصاص أي عازلة إضافية قيد التشغيل.
- إزالة هلام من علبة الجل وفضح هلام للأشعة فوق البنفسجية. هو الأكثر شيوعا ويتم ذلك باستخدام نظام وثائق هلام (الشكل 4). وينبغي أن عصابات الحمض النووي تظهرعلى النحو العصابات فلوري البرتقالي. التقاط صورة من هلام (الشكل 5).
- التخلص السليم من الجل وتشغيل العازلة في لوائح المؤسسة.
4. ممثل النتائج
الشكل 5 يمثل نتيجة نموذجي بعد الكهربائي للهلام الاغاروز من المنتجات PCR. بعد الانفصال، وشظايا من الحمض النووي الناتج مرئية كما نطاقات محددة بوضوح. يجب أن يتم فصل معيار الحمض النووي أو سلم إلى درجة تسمح لتقرير مفيد من أحجام عينة العصابات. في المثال المعروض، ويفصل شظايا من الحمض النووي من 765 شركة بريتيش بتروليوم، BP 880 و بي بي 1022 على جل الاغاروز 1.5٪ جنبا إلى جنب مع سلم DNA 2-السجل.
الشكل 1. جل الاغاروز طدت بعد إزالة المشط.
الشكل 2. على الطالب إضافة إلى صبغ التحميل عينات من الحمض النووي لها.
الشكل 3. الطالب تحميل عينة من الحمض النووي في بئر في هلام.
الشكل 4. مثال على هلام نظام التوثيق.
الشكل 5. صورة لهلام إستشراد آخر. وأضيف إلى EtBr الجل قبل الكهربائي إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / لتر، يليه فصل في 100 فولت لمدة 1 ساعة. تعرضت الجل للأشعة فوق البنفسجية والصورة التي اتخذت مع هلام نظام التوثيق.
Discussion
وقد أثبتت جل الاغاروز الكهربائي إلى أن يكون وسيلة ناجعة وفعالة لفصل الأحماض النووية. قوة الاغاروز في هلام عالية تسمح لمناولة المواد الهلامية انخفاض النسبة المئوية لانفصال شظايا من الحمض النووي كبير. يتم تحديد النخل الجزيئية حسب حجم المسام التي تم إنشاؤها بواسطة حزم من الاغاروز 7 في مصفوفة هلام. بشكل عام، وارتفاع تركيز الاغاروز، أصغر من حجم المسام. جل الاغاروز التقليدية هي الأكثر فعالية في فصل شظايا من الحمض النووي بين 100 كيلوبايت و BP 25. لفصل شظايا من الحمض النووي أكبر من 25 كيلوبايت، واحد في حاجة إلى استخدام نبض هلام إستشراد مجال 6، والتي تنطوي على تطبيق التيار المتردد من اتجاهين مختلفين. وبهذه الطريقة يتم فصل أكبر شظايا من الحمض النووي الحجم من السرعة التي تعيد توجيه نفسها مع التغيرات في الاتجاه الحالي. وعلى نحو أكثر فعالية فصل شظايا من الحمض النووي أصغر من 100 شركة بريتيش بتروليوم باستخدام بولكرلميد الكهربائي للهلام. على عكسالاغاروز المواد الهلامية، ويتم تشكيل مصفوفة هلام بولكرلميد من خلال الجذور الحرة تفاعل كيميائي يحركها. هذه المواد الهلامية هي أرق من تركيز أعلى، يتم تشغيلها عموديا ويكون أفضل قرار. ويستخدم الحمض النووي في تسلسل الحديث الكهربائي الشعري، حيث يتم ملء أنابيب شعرية مع مصفوفة هلام. استخدام أنابيب شعرية يسمح لتطبيق الفولتية العالية، مما يتيح للانفصال شظايا من الحمض النووي (وتحديد تسلسل الحمض النووي) بسرعة.
ويمكن تعديل الاغاروز لخلق منخفض الاغاروز ذوبان من خلال hydroxyethylation. يستخدم عادة منخفضة ذوبان الاغاروز عندما يتم المطلوب عزل شظايا من الحمض النووي المشتتة. Hydroxyethylation يقلل من كثافة التعبئة والتغليف من الحزم الاغاروز، والحد بشكل فعال حجمها المسام 8. وهذا يعني أن جزء الحمض النووي من نفس الحجم وسوف يستغرق وقتا أطول للانتقال من خلال هلام الاغاروز ذوبان منخفضة بالمقارنة مع هلام الاغاروز القياسية. لأن حزم ربط مع بعضها البعضمن خلال المنظمات غير التساهمية التفاعلات 9، فمن الممكن لإعادة صهر 1 هلام الاغاروز بعد أن وضعت.
EtBr هو كاشف الأكثر شيوعا التي تستخدم لصبغ الحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز 10. عندما تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية، يتم تنشيط الإلكترونات في الحلقة العطرية للجزيء إيثيديوم، الأمر الذي يؤدي إلى إطلاق طاقة (الضوء)، وعودة الإلكترونات إلى الحالة الأرضية. EtBr يعمل عن طريق الإقحام نفسها في جزيء الحمض النووي بطريقة تعتمد على التركيز. وهذا يسمح لتقدير كمية من الحمض النووي DNA في أي فرقة خاصة تقوم على شدته. بسبب تهمة إيجابية، واستخدام EtBr يقلل من معدل الهجرة الحمض النووي بنسبة 15٪. EtBr هو المغير المشتبه بهم ومسرطنة، وبالتالي لا بد من توخي الحذر عند التعامل مع المواد الهلامية الاغاروز احتوائه. وبالإضافة إلى ذلك، يعتبر EtBr نفايات خطرة ويجب التخلص منها بشكل مناسب. البقع بديلة للحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز تشمل SYBR الذهب، والأخضر SYBR، بنفسجي كريستال والأزرق الميثيل. من هؤلاء،الميثيل الأزرق والبنفسجي كريستال لا تتطلب التعرض للأشعة فوق البنفسجية هلام للرؤية شرائح الحمض النووي، مما يقلل من احتمال تحور إذا هو المطلوب استرداد جزء من الحمض النووي من الجل. ومع ذلك، والحساسيات هم أقل من EtBr. SYBR الذهب والأخضر SYBR على حد سواء، للأشعة فوق البنفسجية حساسة للغاية تعتمد على الأصباغ مع أقل سمية من EtBr، لكنها أكثر تكلفة بكثير. وعلاوة على ذلك، كل من الأصباغ البديلة إما لا يمكن أن تكون أو لا تعمل بشكل جيد عندما تضاف مباشرة إلى هلام، وبالتالي فإن جل أن تكون ملطخة آخر بعد الكهربائي. نظرا لسهولة وتكلفة الاستخدام، والحساسية، EtBr لا تزال الصبغة المفضل لكثير من الباحثين. ومع ذلك، في حالات معينة، مثل التخلص من النفايات الخطرة عندما يصعب أو عند الطلاب الشباب يؤدون تجربة، قد يكون من المفضل صبغة أقل سمية.
الأصباغ المستخدمة في التحميل الكهربائي للهلام تخدم ثلاثة أغراض رئيسية. لأول مرة إضافة إلى كثافة العينة، والسماح لها تغرق في هلام. ثانيا، توفير الأصباغ لون وتبسيط عملية التحميل. وأخيرا، فإن تحرك الأصباغ في المعدلات القياسية من خلال هلام، والسماح لتقدير المسافة التي شظايا من الحمض النووي قد هاجروا.
ويمكن تحديد أحجام الدقيق للشظايا من الحمض النووي مفصولة المتهم بالتآمر في سجل من الوزن الجزيئي لفرق مختلفة من الحمض النووي ضد معيار المسافة التي تقطعها كل فرقة. مستوى الحمض النووي يحتوي على مزيج من شظايا من الحمض النووي من أحجام محددة مسبقا التي يمكن مقارنتها ضد عينات من الحمض النووي غير معروف. من المهم الإشارة إلى أن أشكالا مختلفة من الحمض النووي التحرك من خلال هلام بمعدلات مختلفة. البلازميد Supercoiled، بسبب التشكل الصغير، وينتقل من خلال أسرع هلام، يليه جزء DNA خطي من نفس الحجم، مع شكل دائري مفتوح يسافر أبطأ.
في الختام، منذ اعتماد المواد الهلامية الاغاروز في 1970s لفصل الحمض النووي، لديهاثبت أن واحدة من التقنيات الأكثر فائدة وتنوعا في بحوث العلوم البيولوجية.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401-212 | Corrosive |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne Incorporated | ||
| Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B1-PTM | |
| EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. , 3rd, (2001).
- Kirkpatrick, F. H.
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
- Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
- Aaji, C., Borst, P.
- Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L.
- Devor, E. J. IDT tutorial: gel electrophoresis. , Available from: http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf (2010).
- Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
- Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
- Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).
