La NADPH oxidasa es la mayor fuente de especies reactivas de oxígeno (ROS) en los fagocitos. Debido a la naturaleza efímera de ROS, es difícil de medir y controlar los niveles de ROS en los animales vivos. Un procedimiento mínimamente invasivo para la cuantificación de serie de ROS en ratones vivos se describe.
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Artículo de método
Bioluminiscencia de imágenes de la actividad NADPH oxidasa en diferentes modelos animales
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Resumen
Resumen
La NADPH oxidasa es una enzima crítica que media la defensa del huésped antibacteriana y antifúngica. Además de su papel en la defensa del huésped antimicrobiana, la NADPH oxidasa tiene funciones críticas de señalización que modulan la respuesta inflamatoria 1. Por lo tanto, el desarrollo de un método para medir en "tiempo real" la cinética de la NADPH oxidasa derivada de la generación de ROS se espera que sea una valiosa herramienta de investigación para comprender los mecanismos pertinentes para la defensa del huésped, la inflamación y lesiones.
La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es un trastorno hereditario de la NADPH oxidasa se caracteriza por infecciones graves y la inflamación excesiva. La activación de la NADPH oxidasa de los fagocitos requiere la translocación de sus subunidades citosólicas (p47 phox, p67 phox y p40 phox) y RAC a un flavocitocromo unida a la membrana (compuesto de una gp91 phox y p22 phox heterodímero). Pérdidade mutaciones de función en cualquiera de estos componentes de la NADPH oxidasa resultado en la EGC. Similar a los pacientes con EGC, gp91 phox los ratones deficientes en p47 y los ratones deficientes tienen phox-defectuoso actividad de la NADPH oxidasa de los fagocitos y deterioro de la defensa de acogida 13, 14. Además de los fagocitos, que contienen los componentes de la NADPH oxidasa descritos anteriormente, una variedad de otros tipos de células expresan diferentes isoformas de la NADPH oxidasa.
Aquí se describe un método para cuantificar la producción de ROS en ratones vivos y para delinear la contribución de NADPH oxidasa para la generación de ROS en modelos de inflamación y lesiones. Este método se basa en el ROS reaccionar con L-012 (un análogo de luminol) para emitir luminiscencia que se registra mediante un dispositivo de carga acoplada (CCD). En la descripción original de la sonda L-012, L-012-dependiente quimioluminiscencia fue completamente abolida por la superóxido dismutasa, que indica que el principal ROS detectado en esta reacción fue superóxido de anión 15. Estudios posteriores han demostrado que la L-012 puede detectar otros radicales libres, incluyendo especies reactivas de nitrógeno 16, 17. Kielland et al. 17 mostraron que la aplicación tópica de acetato de forbol miristato, un potente activador de la NADPH oxidasa, llevado a NADPH oxidasa dependiente de la generación de ROS que podría ser detectado en ratones utilizando la sonda luminiscente L-012. En este modelo, se mostró que la luminiscencia L-012-dependiente fue abolida en p47 phox de ratones deficientes.
Hemos comparado la generación de ROS en ratones de tipo salvaje y NADPH oxidasa deficiente en p47 phox-/ - ratones 2 en los tres modelos siguientes: 1) la administración intratraqueal de zymosan, una célula fúngica pro-inflamatoria pared producto derivado que puede activar la NADPH oxidasa; 2) ligadura cecal y punción (CLP), un modelo de sepsis intraabdominal con la inflamación pulmonar aguda secundaria y lesiones, y 3) el tetracloruro de carbono orales(CCl 4), un modelo de lesión hepática dependiente de ROS. Estos modelos se seleccionaron específicamente para evaluar la NADPH oxidasa dependiente de la generación de ROS en el contexto de la inflamación no infecciosa, sepsis polimicrobiana y lesión inducida por la toxina del órgano, respectivamente. Comparación de bioluminiscencia en los ratones de tipo salvaje p47 phox a-/ - ratones nos permite delinear la contribución específica de ROS generados por p47 phox de la NADPH oxidasa que contiene a la señal bioluminiscente en estos modelos.
Resultados de bioluminiscencia de formación de imágenes que demostraron el aumento de los niveles de ROS en ratones de tipo salvaje en comparación con p47 phox-/ - ratones indicó que la NADPH oxidasa es la fuente principal de la generación de ROS en respuesta a estímulos inflamatorios. Este método proporciona un método mínimamente invasivo para el "tiempo real" monitoreo de la generación de ROS durante la inflamación in vivo.
Protocolo
1. Modelos Animales
- Ratones: Use p47 phox-/ - ratones y la edad y el sexo combinado-ratones C57BL6/DBA. Obtener la aprobación para los experimentos de Cuidado de Animales institucional y el empleo.
- Anestesia: Utilice un sistema de administración continua para inducir la anestesia con isoflurano. El sistema vaporizador (VetEquip) se llena con isoflurano (2-3%). Confirmar que los ratones son completamente anestesiado mediante la observación de la respiración, el movimiento y reflejo corneal en respuesta a estímulos externos.
- Los procedimientos quirúrgicos: Frote el área quirúrgica (de sobremesa) con 70% de etanol. Use ....
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Discusión
"Tiempo real" medición de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en los animales vivos se puede lograr mediante el uso de sondas fluorescentes y quimioluminiscentes. Mientras que las sondas fluorescentes sufren de tener débiles señal-a-ruido 12, se describe la técnica de imagen es más sensible para la detección de la emisión de luz después de una reacción química de ROS con el sustrato luminol basado en L-012. Como todas las técnicas de formación de imágenes bioluminiscentes, esta metodología está .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el NIH RO1 AI079253 y el Departamento de Asuntos de Veteranos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | El número de catálogo | Comentarios |
| L-012 | Wako Chemicals EE.UU., Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| tetracloruro de carbono | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
Referencias
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631(2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995....
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Reimpresiones y permisos
