人牙髓干细胞的分离，鉴定和比较性恒牙使用两种不同的方法，得出

Summary

通过使用所描述的方法分离和鉴定人牙髓干的细胞（hDPSCs）<strong酶解浆（DPSC-ED）</strong>或<strong的直接产物牙髓组织的外植体干细胞（DPSC-OG）。接着</strong><em在体外</em这两种类型的hDPSCs>比较分化成成牙本质细胞。

Abstract

<p class="jove_content">开发智齿容易访问的源干细胞在成年后可以得到常规正畸治疗。人牙髓干细胞（hDPSCs）具有高增殖能力，多系分化能力比较普通的成体干细胞来源<sup> 1-8</sup因此，hDPSCs可能是自体移植，组织工程和再生医学的很好的候选人。除了这些优点，具有间充质干细胞（MSC）的功能，如immunolodulatory效果，使hDPSCs更有价值，即使在同种异体移植的情况下，^6,9,10。因此，使用此的干细胞来源的主要步骤，用于选择最佳的协议，用于隔离hDPSCs从牙髓组织。为了实现这一目标，关键是要研究不同的隔离条件下对不同细胞的行为，如他们共同的表面标记和其分化能力的影响。</p><p class="jove_content"因此，在这里我们分离的人牙髓组织影响第三磨牙，然后用现有文献的基础上协议，用于隔离hdpscs，^11-13<em> IE浏览器</em>牙髓组织中的酶分解的（DPSC ED）或组织块长出（DPSC OG）。在这方面，我们努力促进的隔离方法，使用牙科金刚石盘。然后，将这些细胞其特征在于基质相关的标志物（CD73，CD90，C​​D105和CD44），造血/内皮标志物（CD34，CD45及CD11b）的，血管周围标记，如CD146和STRO-1。此后，这两个协议进行比较的基础上通过定量聚合酶链反应（QPCR）和茜素红染色成牙本质细胞的分化潜能。 QPCR被用于评估矿化相关基因的表达（碱性磷酸酶ALP，基质细胞外磷酸糖蛋白; MEPE牙本质涎磷蛋白; DSPP）。<sup> 14</sup</p>

Introduction

干细胞是细胞克隆细胞具有两个显着的特点，被称为多潜能和自我更新^15。在所有的干细胞不同的复制效力，牙齿干细胞的产后干细胞引起的关注，近年来，因为其可访问性，可塑性强，高增殖能力比较与其他成体干细胞^16。典型地，类似的间充质干细胞，牙髓干细胞粘附的克隆形成有多个成间充质细胞的分化能力和/或非间充质细胞谱系，无论是在体外和体内的细胞，这些细胞^。1-8,17,18稳干细胞鉴定阴性表达造血抗原（ 如 CD45，CD34，CD14），阳性表达的CD90，CD29，CD73，CD105，CD44和^{STRO-1。19,20}

容易获得潜在的疼痛和发病率最低，作为一个有价值的人DPSCS能源间充质干细胞相比普通的来源，如骨髓间充质干细胞^21。在一般情况下，稳干细胞已被分离由任何生长的方法， 即 ，从的牙髓组织外植体^{（DPSC-OG）22-24，}和/或酶消化^{4,6,25（DPSC-ED）}的干细胞的迁移。以往的研究表明，隔离方法和培养条件下，可以吸引不同的人群或谱系体外通道^26,27。在的箱子恒牙（pDPSCs），Huang 等人透露，酶消化pDPSCs超越全部牙髓之中相比，有较高的增殖潜力^，26此外，在箱子乳牙（dDPSCs），它表明一个STRO-1及CD34的标记表示在比较更多的dDPSC-ED与dDPSC-OG。此外，dDPSC-ED显示定义的骨/ odonto介质的高矿化率在²⁷因此，由于出色的潜力DPSCS在regenerative药，将有更多的研究，以更好地了解可能来自不同的隔离方法不同人群的需要。

在这里，它是尝试引入纸浆提取的简单的方法，通过使用一步牙科金刚石盘以方便处理纸浆提取。此外，在申请ED或OG方法的人牙髓源性干细胞的分离，两组间的一般特性及分化能力进行了调查。

Protocol

1。准备的酶液和增殖培养基（PM） 车型胶原酶类型I解：称出I型胶原酶（12毫克/毫升），并溶解在1ml PBS及过滤器，用0.2μm注射器过滤器。然后将其放在15毫升的试管，并保持在-20℃，直到需要。 使分散酶解：称取分散酶（16毫克/毫升），并溶解在1毫升的PBS及过滤器，用0.2μm注射器过滤器。然后将其放在15毫升的试管，并保持在4℃直至需要。 <strong…

Representative Results

酶解（DPSC-ED）是通过以下方式获得的全部牙髓之中这里示出在第10天，15,18（图1）。发起的菌落上形成几乎为3至5天之后，隔离。 超越DPSCS（DPSC-OG），如图2所示。成纤维细胞样细胞开始从牙髓组织迁移到烧瓶平行订购了近5天播种后5天，10日，13日及18。 全部牙髓之中使用这两种方法在通道3的图3中所示，这两种类型的稳干细胞几乎相同的大小…

Discussion

该协议描述了hDPSCs牙髓使用两种方法，酶解和牙髓组织的外植体干细胞的直接产物的分离和鉴定。此外， 在这些细胞的体外分化成成牙本质细胞，通过茜素红S的定量测定＆QPCR评估。

现有的协议，用于隔离从人类牙齿的牙髓组织已被用于各种仪器，如钳子（骨镊子）9，摘除手术中，针^29，格雷西刮匙^30，牙科裂缝毛刺^4，等，这些方法是?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
Flowing Software version 2.3.1