Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs) utilizzando<strong> Dissociazione enzimatica della polpa (DPSC-DE)</strong> O<strong> Conseguenza diretta di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare (DPSC-OG). Seguito da</strong><em> In vitro</em> Differenziazione comparativa di entrambi i tipi di hDPSCs in odontoblasti.
Le cellule staminali sono cellule clonogeniche che possiedono due caratteristiche notevoli, conosciuti come multi-potenza e di auto-rinnovamento 15. Tra tutte le cellule staminali con diverse potenze replicative, le cellule staminali dentali come le cellule staminali post-natali hanno attirato l'attenzione negli ultimi anni, a causa della loro accessibilità, plasticità, e ad alta capacità proliferativa rispetto ad altre cellule staminali adulte 16. Caratteristicamente, simili alle cellule staminali mesenchimali, cellule staminali polpa dentale sono aderenti cellule clonogeniche aventi capacità multipla differenziazione in mesenchima e / o non-mesenchima lignaggi, sia in vitro che in vivo. 1-8,17,18 DPSCs sono identificati da la loro espressione negativa di antigeni ematopoietiche (ad esempio, CD45, CD34, CD14), e l'espressione di CD90 positivo, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1. 19,20
Facile potenziale ottenuto con un minimo sforzo e la morbilità rendere DPSCs umani come un validosorgente in grado di MSC rispetto alle fonti ordinarie, come le cellule staminali mesenchimali del midollo 21. In generale, DPSCs sono stati isolati da una escrescenza metodo, cioè, la migrazione di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare (DPSC-OG) 22-24, e / o mediante digestione enzimatica (DPSC-ED) 4,6,25. Studi precedenti hanno dimostrato che il metodo di isolamento e condizioni di coltura possono indurre differenti popolazioni o casate sotto passaggi in vitro 26,27. Nel caso di denti permanenti (pDPSCs), Huang et al rivelato che enzimatiche pDPSCs digeriti hanno potenziale proliferativo superiore rispetto ai DPSCs cresciuti. 26 Inoltre, nel caso di denti decidui (dDPSCs), è stato dimostrato che STRO-1 e CD34 marcatori espressi più dDPSC-DE rispetto a dDPSC-OG. Inoltre, dDPSC-ED visualizzato elevato tasso di mineralizzazione in definito osteo / odonto media. 27 Pertanto, a causa del potenziale eccezionale di DPSCs in rmedicina egenerative, ulteriori studi saranno necessari per una migliore comprensione delle possibili varie popolazioni che sono derivati da diversi metodi di isolamento.
Qui, era tentativo di introdurre modo semplice di estrazione polpa, utilizzando uno step-disco diamantato dentale per facilitare il processo di estrazione polpa. Inoltre, dopo l'isolamento di polpa umani cellule staminali derivate mediante l'applicazione di metodi di ED o OG, proprietà generali e capacità di differenziazione tra i due gruppi sono stati studiati.
Questo protocollo descrive il processo di isolamento e caratterizzazione di hDPSCs da polpa dentale utilizzando due metodi, dissociazione enzimatica e la conseguenza diretta di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare. Inoltre, in vitro differenziazione di queste cellule in odontoblasti, è stata valutata mediante dosaggio quantitativo Rosso alizarina S & QPCR.
Protocolli esistenti per isolare dal tessuto pulpare dente umano era stato utilizzato diversi strumenti quali p…
The authors have nothing to disclose.
Si ringrazia il Dr. Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei per la loro discus critica e Mohammad Reza Khadem Sharif per i suoi supporti tecnici.
Name of the reagent | Company | Catalogue or Lot. number | Comments (optional) |
α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
EQUIPMENT | |||
BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
Fleurcense Microscope | Olympus | ||
Flowing Software version 2.3.1 |