Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de Plasmodium berghei ANKA de ratones infectados

Resumen

Un método para el aislamiento de los leucocitos inflamatorios adherentes de los vasos sanguíneos cerebrales de los Plasmodium berghei ANKA de ratones infectados se describe. El método permite la cuantificación así como la caracterización fenotípica de los leucocitos aislados después de la tinción con anticuerpos fluorescentes y el posterior análisis por citometría de flujo.

Resumen

Se describe un método para el aislamiento y caracterización de células adherentes inflamatorias de los vasos sanguíneos cerebrales de P. berghei ANKA-ratones infectados. La infección de las cepas susceptibles de ratón con esta cepa del parásito en los resultados de la inducción de la malaria cerebral experimental, un síndrome neurológico que recapitula algunos aspectos importantes de Plasmodium falciparum mediada por paludismo grave en ^1,2 seres humanos. Formas maduras de la malaria en etapa de sangre expresar proteínas parasitarias en la superficie de los eritrocitos infectados, lo que les permite unirse a las células endoteliales vasculares. Este proceso induce obstrucciones en el flujo sanguíneo, lo que resulta en hemorragias hipoxia y ³ y también estimula el reclutamiento de los leucocitos inflamatorios en el sitio de secuestro del parásito.

A diferencia de otras infecciones, es decir, virus neutrotopic ^4-6, ambas parasitados malaria-glóbulos rojos (pRBC) así como Inflamm asociadoAtory leucocitos permanecen secuestrados dentro de los vasos sanguíneos en lugar de infiltrar el parénquima cerebral. Así, para evitar la contaminación de los leucocitos secuestrados con no inflamatorias circulantes, células de perfusión intracardiaca extenso de los ratones infectados antes de la extracción de órganos y procesamiento de tejidos es necesario en este procedimiento para retirar el compartimento de la sangre. Después de la perfusión, los cerebros se cosechan y disecado en trozos pequeños. La estructura del tejido es más interrumpido por tratamiento enzimático con colagenasa D y DNAsa I. El homogeneizado cerebral resultante se centrifugó en un gradiente de Percoll que permite la separación de secuestrados cerebro-leucocitos (BSL) de la mielina y los residuos de otro tejido. Las células aisladas se lavan a continuación, se contaron usando un hemocitómetro y se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para su posterior análisis por citometría de flujo.

Este procedimiento permite la caracterización fenotípica completa de la migración de los leucocitos inflamatorios en el cerebro en rerespuesta a varios estímulos, incluyendo accidente cerebrovascular, así como infecciones víricas o parasitarias. El método también proporciona una herramienta útil para la evaluación de nuevos tratamientos anti-inflamatorios en modelos animales preclínicos.

Protocolo

1. La infección de ratones con P. berghei ANKA-

1. Descongelar una alícuota de criopreservado P. berghei ANKA GRI.
2. Reprime un cerebral malaria resistente a ratones BALB / c de ratón donante (8-12 semanas de edad) mediante la técnica de restricción de dos manos. Inyectar ratón con 100-200 l de pRBC utilizando una jeringa de 1 ml de insulina (28G aguja). Rutinariamente, 1-2 ratones donantes se inyectan.
3. En 4-5 días post-infección (pi) eliminar ratón donante de la jaula y lo coloca en una estación de trabajo o un paño desechable de trabajo.
4. Suavemente contener ratón por el extremo de la cola con unas tijeras pequeñ....

Resultados

Los resultados en la figura. 2 muestran porcentajes y números absolutos de las diferentes poblaciones BSL recuperados de los cerebros de los ratones control perfundidos o unperfused infectadas por la malaria e ingenuo. Aislado BSL fueron teñidas con PE-anti-NK1.1 y anticuerpos APC-anti-TCR-β como se indica en el texto del Protocolo. De acuerdo con resultados anteriores ^7-9, αβTCR ⁺ células T comprende una elevada proporción de la piscina BSL en cerebros de perfundidos infectadas por la malaria rato.......

Discusión

El aislamiento y el análisis de BSL es un método que permite la caracterización y cuantificación de células inflamatorias que migran hacia el cerebro en respuesta a la lesión tisular o la infección en modelos experimentales de ratón. La introducción de un paso de perfusión intracardiaca para la retirada del compartimento de la sangre antes de la extracción de órganos y posterior aislamiento de las células es útil para prevenir la contaminación de células inflamatorias con no inflamatorias leucocitos circulantes. Esto pu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
			Soluciones y tampones
Giemsa azur-eosina-azul de metileno solución	Merck Millipore	1.09204.0500	Dilución 1:10 en agua destilada
Medio RPMI			Ratón tonicidad
Ratón tonicidad PBS			20 mM de fosfato de sodio, 0,149 de NaCl, pH 7,3
0,4% de azul de tripano	Sigma Aldrich	T-8154	Dilución 1:2
La colagenasa D	Worthington Biochemical
DeoxyribonuClease (DNasa) I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	De páncreas bovino
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	30% solución en PBS
Ultrapura Tris	Invitrogen	15505-020
Cloruro de amonio (NH 4 Cl)	AnalaR	10017
Red Cell Lysis Buffer			17 mM Tris, 14nm NH 4 Cl, pH 7,2
FCS	Gibco	1009
EDTA sal disódica	Merck	10093.5V	0,1 M, pH 7,2
			Anticuerpos y conjugados
Anti-ratón CD16/CD32 (Fc Block), clon 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 l en 50 l tampón de tinción (0.5mg/50 ml)
FITC-anti-ratón, clon CD4 H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-anti-ratón NK1.1, clon PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-anti-ratón CD8, clon 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-anti-ratón TCR-β, clon H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-anti-ratón de CXCR3, clon 220803	R & D Systems	FAB1685P
Biotinilado anti-ratón de CCR5, clon C34-3448	BD Pharmingen	559922
Estreptavidina-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Equipos y materiales
SuperFrost portaobjetos de microscopio	Lomb Menzel-Gläser
Pinzas de disección, tijeras	REDA Instrumente
500 ml de PBS reservorio	Nalgene
Caucho tubería
Aguja 23G	BD PrecisionGlide	302008
Disociación celular kit que contiene metal tamiz	Sigma Aldrich	CD-1
70 micras filtro de células de nylon	BD Falcon	352350
Hemocitómetro	Neubauer GmbH	717810
Tubos de citometría de flujo	BD Falcon	352008