$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Microdisección por láser (LMD) es una técnica que permite la recuperación de células y tejidos seleccionados de pequeñas cantidades de parénquima 1,2. Las células disecadas se puede utilizar para una variedad de investigaciones, tales como transcriptomic estudios o proteómica o análisis de evaluación de ADN cromosómico de 2,3. Una aplicación especialmente difícil de LMD es el análisis de transcriptoma, que, debido a la labilidad del ARN 4, puede ser particularmente importante cuando las células se disecan a partir de tejidos que son ricos de RNasas, tales como el páncreas. Un protocolo de microdisección que permite una rápida identificación y colección de las células diana es esencial en este contexto con el fin de acortar el tiempo de la manipulación de tejidos y, en consecuencia, para garantizar la conservación de ARN.
Aquí se describe un protocolo para la obtención humanos las células beta pancreáticas a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para los estudios de transcriptomic 5. Pequeños trozos de páncreas de aproximadamente 0.5-1 c3 m se cortaron de los márgenes sanos que aparecen de páncreas especímenes resecados, embebidos en Tissue-Tek compuesto OCT, se congeló inmediatamente en 2-metilbutano enfriado, y se almacenó a -80 ° C hasta el corte. Cuarenta secciones en serie de 10 m de espesor se cortaron en un criostato en virtud de un ajuste de -20 ° C, se transfirieron individualmente a portaobjetos de vidrio, se seca el interior del criostato durante 1-2 min, y se almacenaron a -80 ° C.
Inmediatamente antes de que el procedimiento de microdisección por láser, las secciones fueron fijadas en hielo frío, recién preparada 70% de etanol durante 30 segundos, se lavó por 5-6 inmersiones en hielo frío agua tratada con DEPC, y se deshidrató por dos incubaciones de un minuto en hielo frío 100% etanol seguido de xileno (que se utiliza para la deshidratación de los tejidos) durante 4 min; secciones de tejido fueron entonces secados al aire después de 3-5 min. Es importante destacar que todas las etapas, excepto la incubación en xileno, se realizaron con reactivos de agua helada - una modificación más de un protocolo descrito previamente 6. Utahilization de reactivos de hielo frío resultó en un aumento pronunciado de la autofluorescencia intrínseca de las células beta, y facilitar su reconocimiento. Para la microdisección, cuatro secciones se deshidrataron cada vez: dos fueron colocados en un tubo de ml envueltas en papel aluminio 50, para proteger el tejido de la humedad y el blanqueo; los dos restantes se microdissected inmediatamente. Este procedimiento se realizó con un PALM MicroBeam instrumento (Zeiss) que utiliza el láser de presión automático Catapulting (AutoLPC) de modo. La finalización de las células beta / islotes disección a partir de cuatro secciones criogénicas requeridos no más de 40-60 min. Las células se recogen en una AdhesiveCap y se lisaron con 10 l de tampón de lisis. Cada espécimen único ARN para el análisis transcriptomic se obtuvo mediante la combinación de 10 muestras de células microdisecadas, seguido de extracción de ARN usando el Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Este protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su reconocimiento rápido y preciso y collection. Nuevas mejoras en este procedimiento podría permitir la disección de las células beta fenotípicamente diferentes, con posibles consecuencias para la mejor comprensión de los cambios asociados con la diabetes tipo 2.