El aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos

Resumen

Este estudio describe una técnica eficiente para aislar y procesar los tejidos gingivales de la cavidad oral del ratón con el fin de producir un cultivo de una sola célula. Las células resultantes pueden ser utilizados además para el análisis de citometría de flujo y los estudios moleculares.

Resumen

Hemos desarrollado una técnica para aislar y procesar precisamente tejido gingival murino para citometría de flujo y los estudios moleculares. La encía es un tejido único e importante para estudiar los mecanismos inmunes, ya que está implicado en la respuesta inmune del huésped contra la biopelícula oral que podría causar enfermedades periodontales. Por otra parte, la estrecha proximidad de la encía al tejido óseo alveolar también permite el estudio de la remodelación ósea en condiciones inflamatorias. Nuestro método produce gran cantidad de células inmunes que permite el análisis de incluso poblaciones de células raras, tales como las células de Langerhans y células T reguladoras como hemos demostrado previamente ^1. El empleo de los ratones para estudiar las respuestas inmunes locales implicadas en la pérdida de hueso alveolar durante enfermedades periodontales es ventajoso debido a la disponibilidad de diversas herramientas inmunológicas y experimental. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y el acceso relativamente inconveniente para la encía murino, muchos estudios evitarse examen de thitejido crítico s. El método descrito en este trabajo podría facilitar el análisis gingival, los que podrán aumentar nuestro subestimando sobre el sistema inmune oral y su papel durante las enfermedades periodontales.

Introducción

Encía es el tejido blando que rodea la porción cervical de los dientes y cubre el proceso alveolar (Figura 1). La encía es un tipo de la mucosa masticatoria que se puede separar más a fondo en epitelio de la mucosa y tejido conectivo (también conocido como submucosa o lámina propia). La estructura anatómica de la encía y los dientes adyacentes permite que las bacterias residen y desarrollan la placa (biopelícula) que desafía continuamente el sistema inmune local. Como resultado, la respuesta inflamatoria se desarrolla en la encía, lo que en ciertas circunstancias se convierte en destructivo - una condición denominada enfermedades periodontales ^2....

Protocolo

Preparar de antemano:

• PBS + 2% de FCS
• PBS + 2% de FCS con 2 mg / ml de colagenasa tipo II y 1 mg / ml de DNasa tipo I (1 ml por muestra)
• Instrumentos quirúrgicos esterilizados
• Solución de EDTA 0,5 M

1. Técnica de escisión gingival superior

1. La eutanasia a los ratones con orientación IACUC aprobado.
2. Corte ambos lados de la cavidad oral, incluyendo las mejillas y la línea de la mandíbula con rectas / romas tijeras rectas.
3. Tire hacia abajo la mandíbula.
4. Cortar los tejidos blandos y duros en una línea imaginaria 1 mm por detrás de los molares tercios con ....

Resultados

Se presentan ejemplos de análisis de citometría de flujo en células de la encía. Células gingivales agrupados a partir de 2 ratones se llevaron a cabo en un citómetro de flujo LSR II y analizados utilizando el software FlowJo. Figura 3A demostraron la distribución de células de la encía de los ratones no tratados previamente en una dispersión lateral (SSC) frente a dispersión trama hacia adelante (FSC). Estrategia de apertura de puerta para identificar (i) linfocitos (ii) los monocitos / células dendrít.......

Discusión

Tejidos gingivales Maxilla obtenidos a partir de un solo ratón son suficientes para el análisis de subpoblaciones de linfocitos T y B, así como su capacidad para expresar moléculas extracelulares e intracelulares como hemos descrito anteriormente en ^1. Sin embargo, si las poblaciones de células raras son de interés (por ejemplo, DC), se recomienda a los tejidos piscina 2-3 ratones. De nota, si así se prefiere, es posible despegar ambos los tejidos gingivales y palatales y luego a impuestos especiales, la encí.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Colagenasa Tipo II	Worthington Biochemical Corp.	CLS-2
DNAse I	SIGMA	DN25-1G
EDTA	SIGMA	E6758-100G
PBS de Dulbecco	SIGMA	D8537
Suero Fetal Bovino	Industrias Biológicas	04-121-1	inactivado por calor
	Jet Biofil	FPE-204-500
5 ml Poliestireno de fondo redondo Tubo	BD Falcon	352052
Filtro de celdas 70 μ m	SPL Lifesciences	93070
Plato de cultivo de tejidos 35× 10 mm	NUNC	153066
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714
Anticuerpo CD11c de	ratón Biolegend		117305 Clon N418
Anti-ratón Anticuerpo CD45.2	Biolegend	109819	Clon 104
Anticuerpo CD4 antiratón	Biolegend	100413	Clon GK1.5
Anti-ratón Anticuerpo CD8a	Biolegend	100733	Clon 53-6.7
Anticuerpo CD3 antiratón	Biolegend	100214	Clon 17A2
Anti-ratón CD326 (Ep-CAM)	Anticuerpo Biolegend	118219	Clon G8.8
Anti-ratón CD207 (Langerin) Anticuerpo	Imgenex	DDX0362D	Clon 929F3.01
Anti-ratón I-Ad (MHC-II) Antobody	Biolegend	115010	Clon 39-10-8
LSR II Citómetro de flujo	BD Biosciences
FlowJo Software v 7.6.5	Tree Star

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