La diferenciación de ratón recién nacido piel derivados de las células madre en células germinales-como<em&gt; In vitro</em

Resumen

En los últimos años la formación de las células germinales que utilizan en los métodos de cultivo in vitro se ha demostrado usando varios tipos diferentes de células madre somáticas. En este artículo se presentará visualmente la diferenciación de las células madre derivadas de ratones recién nacidos a principios de células ovocitos similares.

Resumen

El estudio de la formación de células germinales y diferenciación ha sido tradicionalmente muy difícil debido a los números bajos de células y su ubicación en lo profundo de embriones en desarrollo. La disponibilidad de un "cerrado" en el sistema basado en vitro podría resultar muy valiosa para nuestra comprensión de la gametogénesis. La formación de células similares a los ovocitos (OLC) a partir de células madre somáticas, aislados de la piel del ratón recién nacido, se ha demostrado y se puede visualizar en este protocolo video. Los OLC resultantes expresan diversos marcadores consistentes con ovocitos tales como Oct4, Vasa, Bmp15, y SCP3. Sin embargo, siguen siendo no pueden someterse a la maduración o la fertilización debido a un fallo para completar la meiosis. Este protocolo proporcionará un sistema que es útil para el estudio de la formación de fase temprana y la diferenciación de las células germinales en gametos más maduros. Durante la diferenciación temprana el número de células que expresan Oct4 (potenciales células de gérmenes similares) alcanza ~ 5%, sin embargo actualmente la formación de OLC sigue siendo relativamente ineficiente. El protocolo es relativamente sencillo, aunque se debe tener especial cuidado para asegurar la población de células de partida es saludable y en un paso temprano.

Introducción

Durante la embriogénesis temprana, la gametogénesis se produce a través de una serie de etapas, incluyendo células germinales primordiales (PGC) de formación, la migración, y, finalmente, la colonización de las crestas gonadales. Durante este tiempo las CGP se someten a la proliferación y diferenciación en cada vez más gametos maduros ^1. El hecho de que las CGP migran desde la base de la alantoides en el intestino posterior del embrión y, finalmente, a lo largo de la pared dorsal eventualmente colonizar las crestas gonadales los hace extremadamente difícil de estudiar ^2. A pesar de los avances en el campo, los estudios que intentan comprender la....

Protocolo

1. Medios Preparación

1. Preparar los medios de comunicación 2-3 horas antes de su uso y el lugar con una tapa suelta en el cultivo celular incubadora donde el experimento se llevará a cabo. Los medios utilizados en el presente Protocolo:
   1. Preparar detener medio celular que consiste en DMEM/F12 suplementado con 1 x B27, 40 ng / ml de bFGF, y 20 ng / ml de EGF.
   2. Preparar germen de medio de diferenciación celular que consiste en M199 suplementado con 0,05 UI de FSH, 0,03 UI de LH, 3 mg / ml de BSA, 5 l / ml de STI, 0,23 mM de piruvato sódico, 1 mg / ml de fetuina, y 1 ng / ml de EGF. Un medio de base que consiste de todos los aditivos pero omit....

Resultados

Inicialmente, las células se adhieren a la placa de fondo la cultura y se extienden. En 42-72 h en la diferenciación de células positivas Oct4 pequeñas suspendidas forman y proliferan (Figura 1A). Poco después de la visualización de estas células la mayoría desaparecerá y las células unidas se formará agregados de colonias densas en la parte inferior cultura. Después de unos pocos días estos agregados se separe de la superficie de cultivo. En algunos de estos agregados se puede observar una célula grand.......

Discusión

Hasta la fecha OLC funcionales no se han desarrollado completamente utilizando un ensayo in vitro. Recientemente, un estudio realizado por Hayashi et al. Fue capaz de producir descendencia de PGC-como las células formadas in vitro e in vivo transferido para el desarrollo adicional ^14. A partir de células madre embrionarias o de células pluripotentes inducidas que fueron capaces de formar PGC como las células que, cuando se recuperaron después de trasplante in vivo .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12	Invitrogen	12500
B27	Invitrogen	17504044
EGF	Invitrogen	PHG0311
bFGF	Invitrogen	PHG0266
ITS	Invitrogen	41400-045
BSA	Sigma	A-6003
Piruvato de sodio	Invitrogen	11360-070
Fetuin	Sigma	F3385
FSH	Sioux Biochemicals	915
LH	Sioux Biochemicals	925
M199	Invitrogen	31100-035
Placas de 24 pocillos	Nunc	144530
Platos de 10 cm	VWR	25384-088
15 ml tubos	BD	352095