蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡
Summary
生体顕微鏡は、生きた動物の様々な生物学的プロセスを画像化可能にする強力なツールです。この記事では、生きたマウスの唾液腺では、このような分泌顆粒として細胞内構造のダイナミクスを画像化するための具体的な方法を提示する。
Abstract
ここでは、共焦点生体顕微鏡を使用することに基づいているライブげっ歯類における画像細胞内構造に手順を説明します。彼らはいくつかの利点を提供するため、モデル機関として、我々は、生きたマウスの唾液腺を使用しています。第一に、それらは容易に光学素子へのアクセスを可能にするために露出し、心拍及び呼吸によるモーションアーチファクトの低減を促進するために安定させることができる。これは大幅に画像化し、小さな細胞内構造を追跡を容易にします。第二に、唾液腺の細胞集団の大部分は、器官の表面からアクセス可能である。これは、二光子顕微鏡などのインビボイメージングのために使用されている他の技術よりも高い空間分解能を有する共焦点顕微鏡の使用を可能にする。最後に、唾液腺、容易にこのようにして分子レベルでの生物学的プロセスを調査する堅牢なシステムを提供し、薬理学的および遺伝的に操作することができる。
本研究では、腺房細胞内の分泌顆粒のエキソサイトーシスおよび分泌顆粒は、β-アドレナリン受容体の刺激により融合頂端細胞膜のダイナミクスの動態に従うように設計されたプロトコルに焦点を当てています。具体的には、細胞質ゾル、GFP蛍光タンパク質タンデムトマトと融合した膜を標的とするペプチドを共発現するトランスジェニックマウスを使用していました。しかし、我々は唾液腺を安定させ、画像に使用する手順は、他のマウスモデルに拡張し、そのようなエンドソーム、リソソーム、ミトコンドリアなどの様々な細胞内構造の可視化を可能にする、in vivoでの細胞成分を標識する他のアプローチに結合することができ、アクチン細胞骨格。
Introduction
過去20年間で、ライブ顕微鏡の出現と蛍光タンパク質の使用は、細胞生物1の我々の理解を進め、ありとあらゆる細胞プロセスに大きなブレークスルーにつながっている。このフィールドには、それは実験操作に来る場合は特に、非常に強力なモデル系である哺乳動物細胞培養の使用から途方も恩恵を受けている。しかし、彼らはしばしば、複雑な多細胞生物2の生物学の真の表現を提供していません。この問題は、このような神経生物学、免疫学、腫瘍生物学の3などの分野で重要な生物学的な質問を調査への扉を開いた生体顕微鏡（IVM）の開発によって対処され始めている。今のところ、IVMに基づいて、研究のほとんどは、細胞内区画の動力学に関する情報を提供せずに、組織および個々の細胞のレベルで行われている。最近では、我々の研究室や他のsは、生きたげっ歯類4-7に13〜15細胞内構造を画像化およびインビボでの薬理学的および遺伝的操作を可能にすることができるIVM技術を開発した。このアプローチは、 インビボで膜輸送を研究し、より具体的には、エンドサイトーシスおよび調節性エキソサイトーシス6,7するために我々が使用されている。
我々の実験モデルシステムは、麻酔をかけたげっ歯類の顎下唾液腺（SGSに）安定化とイメージング、露光に基づいています。 IVMのモデル器官としてのSGの選択は、腺小手術を行うことで、容易にアクセス可能であるという事実に起因して、その生理機能を損なうことなく外部化、ハートビートと呼吸によるモーションアーチファクトを低減するために安定させることができる。また、SGsアソシエイトを選択的に唾液管8,9を介して、ウイルスまたは非ウイルスベースのベクターのいずれかを注入することにより、遺伝的に操作することができる。最後に、SGSは偏epithで構成される外分泌腺である腺房や導管、筋上皮細胞、間質細胞の複雑な集団を形成elial細胞。このため、彼らは我々の最近の研究10で強調されているように、エキソサイトーシス、エンドサイトーシス、遺伝子送達、およびアクチン細胞骨格を研究し、そのような細胞極性、細胞分裂、細胞などの細胞生物学の側面を研究する機会を提供するための優れたモデルである細胞間結合、およびイオンチャネル。
本論文では詳細に生きたマウスののSGの上皮で細胞内分解能を達成するための撮影プロトコルを記述します。具体的には、どのように画像を調整されたエキソサイトーシスの間のSGの腺房細胞内の分泌顆粒をするには、show。以前に示されているように、β-アドレナリン受容体のアゴニストで刺激すると、分泌顆粒は、頂端形質膜と融合し、徐々に崩壊し、腺房細管6にその内容を解放する。私たちの目標は、Mと研究者に基本的なツールを提供することです外科的処置の動物取り扱いのinimal経験、それらが正常に細胞内解像度でIVMを実行できるようにします。 IVMの中で最も困難な部分が動物の製造であるので、ここでは、その機能を損なうことなく、SGSに公開し、固定化するために利用されている基本的な手術手順の説明に重点を置いています。全身性蛍光プローブの送達は、トランスジェニック動物の使用、または両方の組み合わせとして細胞内構造、いくつかの戦略を標識するための手順としては、他の箇所に記載されている7,11。
Protocol
Representative Results
Discussion
これまでのところ、細胞内構造は、 インビトロ （ すなわち 、細胞培養）またはex vivoで （ すなわち 、臓器培養、組織切片、腺房の準備）は、多くの場合、完全な生体組織6の特性を再現しないモデル系で主に画像化されています。それは生きているマウスでは、特定の膜輸送の段階（ すなわち規制エキソサイトーシス）の動態を画像化することが?…
Acknowledgements
本研究は、NIHの学内研究プログラム、歯科および頭蓋顔面研究所の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
Referencias
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