Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

Summary

En este protocolo se introduce la fabricación, configuración y operación básica de un biorreactor de picolitros microfluídico (PLBR) para el análisis de microorganismos procariotas de una sola célula. Se analizaron microorganismos de relevancia industrial como prueba de principio, lo que permitió conocer la tasa de crecimiento, la morfología y la heterogeneidad fenotípica durante ciertos períodos de tiempo, lo que difícilmente es posible con los métodos convencionales.

Abstract

En este protocolo se describe en detalle la fabricación, la configuración experimental y el funcionamiento básico del biorreactor microfluídico de picolitros (PLBR) recientemente introducido. El PLBR se puede utilizar para el análisis de bacterias individuales y microcolonias para investigar cuestiones relacionadas con la biotecnología y la microbiología relativas, por ejemplo, al crecimiento celular, la morfología, la respuesta al estrés y la producción de metabolitos o proteínas a nivel de una sola célula. El dispositivo cuenta con un flujo de medio continuo que permite condiciones ambientales constantes para estudios de perturbación, pero también permite cambios rápidos de medio, así como condiciones oscilantes para imitar cualquier situación ambiental deseada. Para fabricar los dispositivos de un solo uso, una oblea de silicio que contenía estructuras SU-8 de tamaño submicrométrico sirvió como molde de replicación para la fundición rápida de polidimetilsiloxano. Los chips se cortaron, ensamblaron, conectaron y configuraron en un microscopio de alta resolución y totalmente automatizado adecuado para imágenes de lapso de tiempo, una poderosa herramienta para el análisis de células espacio-temporales. Aquí, el organismo de la plataforma biotecnológica Corynebacterium glutamicum se sembró en el PLBR y se siguió el crecimiento celular y la fluorescencia intracelular durante varias horas para desentrañar la heterogeneidad de la población dependiente del tiempo a nivel de una sola célula, lo que no es posible con métodos de análisis convencionales como la citometría de flujo. Además de los conocimientos sobre la fabricación de dispositivos, se demuestra la preparación del precultivo, la carga, la captura de bacterias y el cultivo PLBR de células individuales y colonias. Estos dispositivos añadirán una nueva dimensión a la investigación microbiológica para analizar los fenómenos dependientes del tiempo de bacterias individuales bajo un estricto control ambiental. Debido al proceso de fabricación simple y relativamente corto, la tecnología se puede adaptar fácilmente en cualquier laboratorio de microfluídica y simplemente se adapta a necesidades específicas.

Introduction

La microscopía de lapso de tiempo es una poderosa herramienta para estudiar células vivas in vivo¹. Mientras tanto, las plataformas de microscopía totalmente automatizadas disponibles en el mercado, incluida la compensación de la deriva del foco inducida térmicamente, se aplican comúnmente en la investigación biológica para estudiar fenómenos dependientes del tiempo, que van desde la investigación de células cancerosas y neuronales hasta la ingeniería de tejidos y estudios dinámicos con células individuales de levadura o bacterias^2-6.

Por lo general, se aplican placas de pocillos transparentes, almohadillas de agar o simplemente portaobjetos de microscopía para proporcionar entornos de cultivo celular durante la obtención de imágenes de lapso de tiempo⁷. A pesar de ser adecuados para ciertas investigaciones, estos sistemas simples tienen un control muy limitado sobre las condiciones ambientales y no permiten perturbaciones más complejas o cambios de medio bien definidos y rápidos. Los dispositivos de chip microfluídico desechables producidos en masa se han introducido en el mercado recientemente, pero en su mayoría están diseñados^{para tipos de} células eucariotas más grandes. Aunque se puede seguir el crecimiento, las investigaciones de crecimiento bien definidas relativas, por ejemplo, a la captura precisa de células, el tamaño de la colonia, la dirección del crecimiento y la capacidad de eliminación de células son limitadas. Los hábitats y reactores microfluídicos, en los que se cultivan células bacterianas en ambientes 3D se han desarrollado^8-10, tienen inconvenientes cuando se trata de estudios cuantitativos a nivel de una sola célula. Si bien se puede analizar la heterogeneidad general de la población, muchos parámetros celulares no se pueden determinar con precisión con la resolución de una sola célula, ya que el crecimiento no se restringe a monocapas.

Esta limitación desencadenó el desarrollo de microsistemas que permiten el cultivo de células en canales y hábitats bien definidos, con células que crecen en monocapas planas con resolución de una sola célula y un control especialmente estricto sobre el suministro de medios y las condiciones ambientales^6,11,12. Se han demostrado pocos ejemplos de sistemas microfluídicos para el cultivo de células bacterianas^12-14. Las bacterias suelen exhibir tasas de crecimiento muy rápidas y requieren estructuras microfluídicas en el rango de unos pocos micrómetros o menos, especialmente cuando se desean monocapas celulares para la microscopía. Keymer y cols. Crecimiento y propagación demostrados de cepas de E. coli en paisajes microfabricados^15,16. Como estaban interesados en la dinámica de poblaciones, no investigaron con resolución de una sola célula.

Hemos desarrollado el biorreactor de picolitros (PLBR)¹³, que actualmente se aplica para investigar diversos indicadores de rendimiento biotecnológico como el crecimiento¹⁷ y el análisis de productividad acoplado a fluorescencia a nivel de una sola célula^18,19. El actual dispositivo microfluídico permite el control del reactor ambiental a un volumen de cultivo definido de aproximadamente un picolitro y la observación continua de una sola célula simultáneamente. En comparación con los sistemas de caja monocapa abierta^11,14, donde uno o dos lados están abiertos al canal de suministro de medios, el PLBR permite el atrapamiento y cultivo controlados. El diseño permite el cultivo a largo plazo de bacterias sin el riesgo de que varias colonias adyacentes formen una gran población. Además, el sistema incorpora regiones de cultivo de 1 μm de altura (en el orden del diámetro de la célula) para restringir el crecimiento de las bacterias a monocapas celulares. Por el contrario, los canales de suministro son 10 veces más profundos para minimizar la resistencia hidráulica.

En comparación con los sistemas de cultivo por lotes miniaturizados²⁰, el sistema actual permite el cultivo con parámetros ambientales constantes debido al flujo continuo de medios. Además, los parámetros ambientales, como la composición del medio, la temperatura, los caudales y el intercambio de gases, se pueden controlar y cambiar fácilmente en cuestión de segundos. Esto permite investigaciones específicas de la respuesta celular a los cambios ambientales relativos, por ejemplo, a la disponibilidad de nutrientes o a los estímulos de estrés. La demanda de volúmenes de medios reducidos, es decir, en el rango de unos pocos microlitros solamente, permite a los investigadores realizar estudios novedosos, por ejemplo, la perturbación de las células durante la obtención de imágenes de lapso de tiempo con sobrenadante de experimentos a gran escala que desentrañan la respuesta celular en estas condiciones ambientales específicas¹⁷. El biorreactor de picolitros proporciona a los investigadores un sistema robusto que controla estrictamente las condiciones biofísicas y funciona mediante bombas de jeringa de alta precisión y microscopía automatizada de campo claro y fluorescencia para obtener imágenes de lapso de tiempo. Aquí, informamos un protocolo completo que incluye el diseño del dispositivo, la fabricación y las aplicaciones ejemplares.

Protocol

1. Fabricación de obleas

1. Diseñe el dispositivo microfluídico que contiene las entradas, salidas, canales principales y los PLBR (Figura 1A) utilizando software CAD.
2. El diseño presentado en este protocolo (Figura 2) consta de dos entradas de siembra, un generador de gradiente para la mezcla de dos sustratos diferentes, una salida y seis matrices de PLBRs. Cada matriz contiene 5 PLBR, lo que da como resultado 30 PLBR paralelos dentro de un dispositivo microfluídico.
3. Cree una fotomáscara de litografía que contenga los diseños de chips deseados (Figura 1B). La fotomáscara fue producida internamente por escritura por haz de electrones con resolución submicrónica. La mascarilla utilizada estaba compuesta por una capa de cromo sobre una placa de vidrio 5 en².
   Nota: realice todos los pasos siguientes en condiciones de sala limpia de clase 100 o superior (en las Figuras 3A y 3B se muestra un diagrama de flujo del proceso).
4. Limpie una oblea de silicona de 4 pulgadas con piraña (proporción de 10:1 de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno) y ácido fluorhídrico durante varios minutos (Precaución: productos químicos peligrosos). Enjuague con agua desionizada (DI) durante aproximadamente 10 segundos.
5. Deshidratar la oblea durante 20 min a 200 °C.
6. Aplicar una capa de centrifugado de 1 μm SU-8 2000.5 fotorresistente sobre la oblea (^1ª capa) (resistencia de 4 ml, centrifugar 10 segundos con, v = 500 rpm y a = 100 rpm/seg, centrifugar 30 segundos con v = 1.000 rpm y a = 300 rpm/seg).
7. Coloque la oblea recubierta en una placa calefactora a 95 °C para eliminar el exceso de disolvente (1,5 min a 65 °C, 1,5 min a 95 °C y 1 min a 65 °C; lo ideal es utilizar dos placas calefactoras).
8. Inserte la fotomáscara de^1ª capa (aquí las regiones de captura de los reactores de picolitros) y la oblea dentro del alineador de la máscara y exponga la oblea a 350-400 nm (contacto de vacío, 64 mJ/cm², t = 3 seg, I = 7 mW/cm²).
9. Realice el horneado posterior a la exposición en una placa calefactora a 95 °C para iniciar la polimerización de SU-8 (1 min a 65 °C, 1 min a 95 °C y 1 min a 65 °C). Nota: después de este paso se pueden ver las estructuras en la capa SU-8.
10. Coloque la oblea en un baño de revelador SU-8 durante 1 minuto y transfiera la oblea a un segundo recipiente con revelador SU-8 fresco durante unos segundos.
11. Enjuague la oblea con isopropanol para eliminar el revelador SU-8 y seque la oblea utilizando el flujo de nitrógeno del centrifugador de obleas.
12. Hornee la oblea durante 10 minutos a 150 °C.
13. Aplicar una capa de centrifugado de 9 μm SU-8 2010 photoresist sobre la oblea (^2ªcapa) (dispensar 4 ml de resistencia, centrifugar 10 seg con v = 500 rpm, a = 100 rpm/seg, y centrifugar 30 s con v = 4.000 rpm, a = 300 rpm/seg).
14. Coloque la oblea con SU-8 en una placa calefactora a 95 °C para eliminar el exceso de disolvente (15 min a 65 °C, 45-60 min a 95 °C y 10 min a 65 °C). Nota: hay que prestar atención a las arrugas y las burbujas. Si la oblea se calienta a 95 °C, el disolvente evaporado puede encapsularse en pequeñas burbujas de gas.
15. Inserte la fotomascarilla con el diseño deseado (aquí canales principales para el suministro de nutrientes) y la oblea en el alineador de mascarillas y exponga a 350-400 nm (contacto duro, 64 mJ/cm², t = 10 seg, I = 7 mW/cm²)
16. Realice el horneado posterior a la exposición en una placa calefactora a 95 °C para finalizar la polimerización de SU-8 (5 min a 65 °C, 3:30 min a 95 °C, 3 min a 65 °C). Nota: después de este paso se pueden ver las estructuras en la capa SU-8.
17. Coloque la oblea en un baño de revelador SU-8 durante 45 segundos, transfiera la oblea a un segundo recipiente con revelador SU-8 fresco y revele durante 60 segundos.
18. Enjuague la oblea durante 20 segundos con isopropanol para eliminar cualquier residuo de revelador SU-8 y seque la oblea con nitrógeno a presión.
19. Por último, hornee la oblea a 150 °C. Como resultado se obtiene la oblea final (Figura 1C), que se utilizará como molde maestro para el moldeo de PDMS.
20. Realice mediciones de perfilómetro (Figura 3C) para validar las alturas de la estructura SU-8. Nota: las imprecisiones en la altura de la estructura pueden resultar en una captura ineficiente de las células o en la pérdida de células durante el cultivo.

2. Fabricación de chips de polidimetilsiloxano

Nota: Todos los pasos siguientes deben realizarse idealmente en condiciones de flujo laminar para evitar que las partículas de polvo interfieran con el procedimiento de fabricación (en la Figura 4 se muestra un diagrama de flujo del proceso).

1. Prepare una mezcla de base de polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado en una proporción de 10:1. Mezcle con cuidado hasta lograr una solución homogénea que se vea opaca. Prepare todo lo que sea necesario para la altura de capa deseada (aquí 3 mm).
2. Desgasifique la mezcla de PDMS durante aproximadamente 30 minutos bajo un ligero vacío hasta que todas las burbujas hayan desaparecido.
3. Prepare el dispositivo de moldeo (o placa de Petri) con la oblea SU-8 adecuada y vierta la mezcla de PDMS en ella (Figura 1D).
4. Hornee el PDMS durante 3 horas a 80 °C en el horno.
5. Despegue con cuidado la losa de PDMS de la oblea. Corta la losa en trozos individuales con un bisturí limpio y afilado.
6. Lave las papas fritas en un baño de n-pentano durante 90 minutos, seguido de dos baños de lavado con acetona (90 minutos cada uno). Seque las virutas durante la noche para eliminar cualquier residuo de disolvente. Precaución: realice el lavado del PDMS bajo una campana extractora. Nota: durante el lavado con n-pentano, los monómeros y dímeros se eliminan del PDMS curado y el tamaño de la viruta puede duplicarse temporalmente durante el procedimiento de lavado.
7. Almacene los chips PDMS microfluídicos en recipientes cerrados hasta el experimento final.
8. Justo antes del experimento, perfore los orificios de entrada y salida en el chip PDMS con una aguja (o perforadora) con un diámetro ligeramente más pequeño que los conectores que se utilizan para conectar tubos con el chip PDMS.
9. Limpie cuidadosamente el chip microfluídico de PDMS con isopropanol y use cinta adhesiva para eliminar cualquier partícula de polvo que pueda adherirse al lado estructurado del PDMS. Use la cinta adhesiva varias veces hasta que no se vea ninguna partícula en el chip.
10. Limpie sucesivamente un portaobjetos de vidrio fino de 170 μm con acetona e isopropanol. Finalmente limpiar con agua desionizada y secar con nitrógeno a presión.
11. Antes de la activación del plasma, caliente el limpiador de plasma y haga funcionar el plasma durante aproximadamente 300 segundos. Portaobjetos de vidrio oxidado por plasma y chip PDMS (Potencia 50 W, Tiempo = 25 segundos, Caudal de oxígeno = 20 sccm).
12. Alinee el PDMS y el chip de vidrio antes de unir. Finalmente, coloque el chip PDMS con cuidado en el portaobjetos de vidrio (Figura 1E). El PDMS y el vidrio se unirán en cuestión de segundos. Nota: no empuje con pinzas la parte superior del chip PDMS durante el proceso de unión. Esto puede provocar el llamado colapso del techo de los canales y pequeñas estructuras.
13. Para fortalecer la unión, hornee el chip final de vidrio PDMS durante 10 segundos a 80 °C.

3. Preparación del cultivo bacteriano

Nota: Todos los cultivos deben prepararse en medio filtrado estéril para evitar la acumulación de partículas no deseadas, que pueden interferir durante el cultivo.

1. Utilice una placa de agar que contenga los organismos deseados (en este caso, C. glutamicum ATCC 13032) e inocule una colonia en 20 ml de medio BHI fresco, incube durante la noche (≈ 8-14 h) a 30 °C en un agitador giratorio (120 rpm).
2. Transfiera 10 μl del precultivo al medio deseado (en este caso, CGXII²¹) que se utilizará durante el cultivo microfluídico y deje que la célula crezca durante la noche a 30 °C en un agitador rotativo (120 rpm).
3. Transfiera la cantidad deseada de suspensión celular (entre 10 y 500 μl, dependiendo del inicio del experimento) al medio deseado (aquí CGXII²¹) que se utilizará durante el cultivo de células microfluídicas. Nota: lo mejor es usar celdas de la fase logarítmica temprana para la siembra. Para el cultivo de C. glutamicum, la mejor densidad óptica (OD₆₀₀) para la siembra estuvo entre 0,5 y 2.
4. Transfiera 1 ml del cultivo bacteriano a un tubo estéril de 2 ml. Nota: esto debe hacerse justo después de ensamblar el chip PDMS microfluídico para minimizar el tiempo de transferencia entre el matraz de agitación y el cultivo microfluídico. Por lo general, el tiempo de transferencia es de alrededor de 15 minutos y debe mantenerse lo más pequeño posible para evitar el impacto en el metabolismo causado por la limitación de oxígeno y los cambios de temperatura.

4. Configuración experimental

Nota: Todos los pasos se realizan con un microscopio invertido.

1. Encienda la incubadora del microscopio 2 horas antes del experimento para calentar el sistema. Nota: la microscopía debe estar equipada con una incubadora de tamaño completo para controlar la temperatura y, si se desea, el flujo de gas. No es necesario un control de humedad adicional, ya que el sistema de chips se infunde continuamente con medios.
2. Abra el sistema de incubadora, seleccione el objetivo deseado y, si es necesario, agregue aceite de inmersión al objetivo.
3. Monte el chip dentro del soporte para chips. Si es necesario, fije la placa de vidrio con cinta adhesiva para evitar cualquier movimiento durante el funcionamiento del escenario.
4. Centre la muestra en el microscopio y concéntrela en las matrices PLBR.
5. Conecte las entradas y salidas con la tubería adecuada (Figura 1F). Conecte la tubería a un depósito de desechos. Un chip representativo se puede ver en la Figura 4D.
6. Inserte las jeringas en las bombas e inicie el flujo de medios. Utilice medio, tampón o, si es necesario, solución de recubrimiento y enjuague los canales microfluídicos durante aproximadamente 1 hora. Nota: la solución de recubrimiento se utiliza para recubrir las paredes del canal para evitar la adhesión celular inespecífica.
7. En el caso de E. coli, se utiliza una solución al 0,1% de BSA para recubrir las paredes del canal. Para C. glutamicum no es necesario ningún recubrimiento. Después del procedimiento de recubrimiento, enjuague la viruta con medio antes de la siembra de celdas.
8. Antes de la siembra y el cultivo de células, compruebe que no se produzcan fugas y que la temperatura sea constante.

5. Siembra de células bacterianas en el dispositivo microfluídico

1. Asegúrese de que las soluciones bacterianas deseadas estén disponibles en jeringas adecuadas conectadas a los tubos.
2. Desconecte el tampón o la solución de recubrimiento y conecte la suspensión de la celda al chip. Para minimizar el volumen de muerte, las burbujas de aire no deseadas y reducir el tiempo experimental, cambie la aguja completa, así como el tubo, en lugar de solo las jeringas.
3. Infundir la suspensión celular en los canales a un caudal volumétrico de 200 nl/min hasta que la mayoría de los PLBR se llenen con la cantidad deseada de celdas (Figura 5A). Nota: los resultados óptimos de siembra dependen de la cepa bacteriana, OD₆₀₀ y del medio de crecimiento del precultivo. Estos parámetros deben adaptarse para aumentar la eficiencia y el tiempo de captura hasta que un número suficiente de células queden atrapadas en las estructuras del reactor. Para C. glutamicum, típicamente se utilizó una suspensión celular de OD₆₀₀ 0.5-2; para E. coli el OD₆₀₀ estuvo entre 0,5-1.
4. Si solo se llena un pequeño número de PLBR, aumente el caudal a 800-1.200 nl/min.
5. Desconecte la suspensión celular y conecte el medio de crecimiento al chip (Figura 5B). Asegúrese de que no se introduzca ninguna burbuja de aire durante el cambio de medio. Perfundir con medios de crecimiento frescos a 100 nl/min.

6. Imágenes de lapso de tiempo

1. Seleccione PLBR específicos para imágenes de lapso de tiempo. Por lo general, se eligen PLBR que contienen una sola célula madre al comienzo de un experimento. El número de regiones de interés que se pueden investigar en un experimento depende de la velocidad de fotogramas deseada y de la configuración microscópica.
2. Seleccione una velocidad de fotogramas adecuada en función del número de PLBR. Asegúrese de que el microscopio pueda manejar la cantidad deseada de ROI en el intervalo de lapso de tiempo.
3. Elija los conjuntos de filtros adecuados (aquí YFP). Cierre automáticamente el obturador durante el movimiento del escenario y después de cada medición de lapso de tiempo para evitar el blanqueo de cromóforos.
4. Configure la secuencia de microscopía de lapso de tiempo e inicie el experimento.
5. Una vez que todos los PLBR están demasiado crecidos, el experimento se puede detener, el chip PDMS microfluídico se puede descartar y el experimento se puede evaluar.

7. Análisis

Nota: Los siguientes pasos o partes del procedimiento se pueden realizar manualmente o mediante programas de análisis de imágenes como ImageJ, etc.

1. Determine los PLBR de interés en los que el cultivo cumple con todos los criterios deseados, por ejemplo, número de células madre, posición de las células madre, etc.
2. Para determinar la tasa de crecimiento de una microcolonia, cuente el número de células en cada período de tiempo.
3. Calcule la tasa de crecimiento máxima trazando el tiempo frente a ln (número de celda). La pendiente de la gráfica representa la tasa de crecimiento en [1/h] (ver Figura 6).
4. El análisis de datos de fluorescencia depende en gran medida del experimento realizado. En este informe, se eligió un ejemplo para ilustrar la heterogeneidad de colonia a colonia y de célula a célula entre diferentes microcolonias isogénicas (ver Figura 7).

Results

Fabricación de dispositivos

El sistema PLBR microfluídico está fabricado por una capa de PDMS unida a un fino chip de vidrio adecuado para la microscopía de alta resolución. La fabricación consta de dos pasos principales: en primer lugar, la fabricación del maestro de replicación (Figuras 1A, 1B y 1C) y, en segundo lugar, la fabricación del chip (Figuras 1D, 1E y 1F). De acuerdo con el protocolo, se utilizan técnicas estándar de microfabricación fotolitográfica para crear el molde maestro. Los laboratorios sin instalaciones de sala limpia pueden adquirir moldes maestros SU-8 personalizados disponibles en el mercado. Utilizando el moldeo repetitivo de PDMS (Figuras 1A, 1B y 1C) se pueden producir cientos de chips desechables. El moldeo y el ensamblaje de chips de PDMS se pueden realizar en cualquier laboratorio y no requieren instalaciones de sala limpia, sin embargo, los lugares de trabajo de flujo de aire laminar son favorables.

El proceso comienza con el diseño del sistema de chip microfluídico. Por lo general, se utiliza software CAD para diseñar el chip microfluídico (Figura 1A). Después de CAD, se genera una máscara mediante un escritor de haz e (Figura 1B) con una resolución submicrónica. En el presente estudio se creó una máscara de 5 en cromo que se utilizó para la litografía de la oblea SU-8. La oblea final de silicio, SU-8, se utiliza para el moldeo de PDMS (Figura 1D). Después de un paso de horneado, la losa de PDMS se corta en virutas que se unen irreversiblemente a los portaobjetos de vidrio (Figura 1E). Finalmente, se conecta el tubo (Figura 1F).

La figura 2 muestra el diseño del sistema microfluídico en detalle. Consta de dos entradas de siembra, un generador de gradiente para la mezcla de diferentes sustratos o medios y una salida. Los canales principales tienen una dimensión de 50 μm x 10 μm (ancho x alto). Cada dispositivo consta de seis matrices de PLBR, que contienen 5 PLBR cada una. Esto da como resultado 30 reactores paralelizados dentro de un dispositivo microfluídico.

La Figura 3 ilustra la producción del maestro de replicación. Como se describe en detalle en el protocolo, una primera capa de SU-8 se fabrica mediante litografía SU-8 (Figura 3A). Un procedimiento similar se aplica para la segunda capa (Figura 3B). Para comprobar la geometría de los canales, se investigó la altura de los PLBR y de los canales principales utilizando un perfilómetro. En el ejemplo que se muestra en la Figura 3C, se midió la primera capa (la capa de cultivo). Aquí la capa muestra una altura constante de 1.200 nm, adecuada para el cultivo de C. glutamicum en medio BHI.

La Figura 4 ilustra el procedimiento de moldeo de PDMS comenzando con la mezcla de PDMS (Figura 4A), seguido por el proceso de moldeo (Figura 4B) y finalmente el paso de unión (Figura 4C). La Figura 4D muestra el chip microfluídico final que incorpora la placa de vidrio de 170 μm de espesor, el chip PDMS (3 mm de altura) con entradas y salidas y agujas de acero conectadas a la tubería. Después del experimento, el chip se puede desechar y no es necesaria una limpieza exhaustiva. Además, es fácil de montar y manejar. No es necesario un procedimiento de llenado complejo y difícil.

Principio del dispositivo

La figura 5 muestra el principio de funcionamiento del sistema del reactor. Las células se infunden en el dispositivo microfluídico y las células individuales permanecen atrapadas dentro del PLBR simplemente por interacciones entre la pared celular y la pared. Debido a la diferencia en la resistencia hidrodinámica del canal y el PLBR, solo se produce un flujo mínimo dentro del PLBR. Después de la siembra del PLBR (Figura 5A), se inicia la fase de crecimiento y observación con un cambio de solución bacteriana a medio de crecimiento (Figura 5B). Una vez que los PLBR se han crecido demasiado (Figura 5C), el experimento generalmente se detiene y se pueden analizar las imágenes de lapso de tiempo. Para los mecanismos de atrapamiento y el perfil de flujo dentro del PLBR, el lector se remite a Grünberger et al.¹³ para más detalles.

Análisis de la Tasa de Crecimiento

El presente sistema se puede aplicar para estudiar varias especies bacterianas con respecto a diferentes parámetros biológicos como el crecimiento, la morfología o una señal fluorescente. En un primer ejemplo, C. glutamicum, un organismo de producción de relevancia industrial, se cultivó en condiciones de cultivo estándar (T=30 °C, medio CGXII²¹). La Figura 6A muestra las curvas de crecimiento derivadas de tres microcolonias isogénicas. El crecimiento exponencial se mantiene hasta que se llenan los PLBR, lo que indica que no se produce ninguna limitación de nutrientes. La Figura 6B muestra cuatro imágenes de microscopía de lapso de tiempo DIC de una colonia de C. glutamicum en crecimiento.

Análisis de fluorescencia

Para la microscopía de fluorescencia de una sola célula, los investigadores a menudo hacen uso de proteínas fluorescentes específicas, por ejemplo GFP o derivados, para acoplar un fenotipo específico de interés a una salida medible (una señal fluorescente). Para demostrar la aplicabilidad del PBLR para estudios de lapso de tiempo basados en fluorescencia, investigamos la emisión de fluorescencia de una cepa de C. glutamicum que produce una proteína de fusión YFP-TetR codificada por plásmidos bajo el control del promotor Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)^18,22. En presencia de concentraciones bajas de inductores (IPTG), se sabe que la expresión de Ptac conduce a una variación significativa de célula a célula en las poblaciones bacterianas isogénicas. A partir de un precultivo, se siguió el crecimiento y la fluorescencia unicelular para varias microcolonias isogénicas. Como se puede observar en la Figura 7, observamos heterogeneidad fenotípica entre diferentes microcolonias y heterogeneidad a nivel de una sola célula dentro de colonias a partir de una célula madre. Una colonia (Figura 7B, PLBR 1) casi no mostró emisión de fluorescencia, mientras que las células de PLBR 2 exhibieron una baja emisión de fluorescencia debido a la expresión basal de yfp-tetR del promotor Ptac. En PLBR 3 la emisión de fluorescencia fue considerablemente fuerte en comparación con las otras colonias y se observó una amplia distribución de la población. Este ejemplo demuestra la aplicabilidad del PBLR para estudios de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. En comparación con la citometría de flujo, en la que la fluorescencia de células individuales se puede determinar en un punto de tiempo, los sistemas actuales permiten el seguimiento de las células y el estudio de la fluorescencia de una sola célula en tiempo real durante muchas generaciones.

Figura 1.Descripción general del proceso de producción de chips PLBR. Fabricación de moldes maestros: comenzando con (A) Diseño, (B) Fabricación de máscaras de litografía y (C) Producción de obleas. Producción de chips de vidrio PDMS: comenzando con (D) de moldeo PDMS, seguido de (E) unión de vidrio y PDMS y (F) ensamblaje final de chips.

Figura 2: Diseño del chip PLBR. (A) Dibujo CAD de todo el chip microfluídico; (B) Ampliación de las posiciones de diseño seleccionadas: El diseño contiene dos entradas de medio (a1), un generador de gradiente con canales de mezcla (a2) y 6 matrices PLBR paralelas (b1). b2 muestra un PLBR, que está incrustado en un canal de fluido con un ancho de 100 μm. El PLBR tiene un diámetro interior de 40 μm y canales de nutrientes de 2 μm de ancho. La entrada de siembra tiene una longitud de 40 μm. El color rosa representa la primera capa (región de captura y cultivo) y el color azul representa la segunda capa (transporte de fluidos).

Figura 3.Ilustración del proceso de fabricación de obleas de dos capas. (A) Fabricación de la primera capa que contiene estructuras de captura; (B) Fabricación de la segunda capa que contiene canales, entradas y salidas de fluidos; (C) Perfiles superficiales representativos de la primera capa. En este caso la altura de la primera capa fue de 1.200 nm y se utiliza para el cultivo de C. glutamicum en medio complejo.

Figura 4.Fabricación de dispositivos y chip representativo. Ilustración del proceso de moldeo de PDMS: (A) Mezcla y desgasificación de PDMS; (B) moldeo de PDMS; (C) desmoldeo, corte y unión de virutas. Chip final (Reproducido con permiso de la Royal Society of Chemistry¹³): (D) fotografía del chip PDMS con 2 entradas y 1 salida; (E) Imagen CAD de seis matrices paralelas que contienen 5 PLBR cada una; (F) Imagen SEM de un PLBR.

Figura 5. Principio de funcionamiento del sistema PLBR. A) Fase de siembra; (B) Fase de crecimiento de las microcolonias bacterianas; (C) Fase de desbordamiento. Reproducido con permiso de la Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

Figura 6.Determinación de la tasa de crecimiento de microcolonias WT de C. glutamicum. (A) Parcela de crecimiento de tres cultivos PLBR y las curvas exponenciales resultantes (Partes reproducidas con permiso de la Royal Society of Chemistry)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Imágenes de lapso de tiempo de una colonia de C. glutamicum en crecimiento.

Figura 7. Análisis de la heterogeneidad poblacional basado en PBLR. Se muestra C. glutamicum expresando una fusión yfp-tetR bajo el control del promotor Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) en ausencia del inductor IPTG. (A) Flujo de trabajo experimental; (B) Tres microcolonias isogénicas que muestran heterogeneidad de colonia a colonia y heterogeneidad de célula a célula; (C) Distribución de la fluorescencia unicelular dentro de las microcolonias respectivas.

Figura 8. Imágenes electrónicas de barrido de diferentes PLBRs. Imágenes SEM que muestran las entradas de siembra para la optimización de la eficiencia del trapping. (A) Entradas de siembra Lager (B) Entradas de siembra más pequeñas (C) Entradas de siembra "abiertas" más grandes (D) Dos entradas de siembra.

paso	problema	Posible razón	solución
Fabricación de obleas	Burbujas de aire atrapadas en SU-8 durante el horneado suave	Aumento de la temperatura a rápido	Hornear a 95 °C y 65 °C varias veces
Fabricación de obleas	Estructuras SU-8 desaparecidas y rotas	Procedimiento de fabricación no óptimo; tensión mecánica en estructuras SU-8	Optimice parámetros como el tiempo de horneado, el tiempo de exposición
Fabricación de obleas	Capas SU-8 a espesor de capa bajo, alto o desigual	Problema durante el recubrimiento por centrifugación	Verifique los parámetros del spin-coater y el mandril de la oblea
Pegado y ensamblaje de chips	Colapso de PLBR	Los parámetros de unión de PDMS no son óptimos	Ajuste la potencia, el tiempo de exposición al plasma y el tiempo de horneado después de la unión
Pegado y ensamblaje de chips	Estructuras y partículas sucias en los PLBR	El chip no se limpió correctamente	Aplique cinta adhesiva para la limpieza de superficies
Pegado y ensamblaje de chips	Unión insuficiente PDMS-vidrio	Parámetros de unión no óptimos o limpieza insuficiente	Comprobar la configuración del plasma de oxígeno
Experimento Microfluídico	Fuga de fluido	El orificio de entrada/salida no se perforó correctamente	Optimice el proceso de perforación de orificios
Experimento Microfluídico	Muchas partículas pequeñas de PDMS durante el llenado	El agujero no se perforó correctamente	Optimice el proceso de perforación de orificios
Experimento Microfluídico, Aspecto Biológico	Sin crecimiento celular	Residuo de disolvente del procedimiento de limpieza	Enjuague la viruta más extensamente antes de la carga de la celda o deje que el solvente se evapore antes de la unión
Experimento Microfluídico, Aspecto Biológico	Cambios en las tasas de crecimiento	Varias razones	Comprobar el precultivo y la temperatura
Experimento Microfluídico, Aspecto Biológico	Cambios en la morfología celular durante el cultivo	Limitaciones de nutrientes o cambio de temperatura	Compruebe la incubadora y el caudal
Experimento Microfluídico, Aspecto Técnico	Deriva en posición durante la microscopía de lapso de tiempo	Fluctuaciones de temperatura	Verifique el perfil de temperatura antes de los experimentos hasta que no haya oscilación
Experimento Microfluídico, Aspecto Técnico	Pérdida de células durante el cultivo	Altura del reactor de leve a alta	Optimice la altura del reactor
Experimento Microfluídico, Aspecto Técnico	Sin trampas	Altura del reactor demasiado baja	Optimice la altura del reactor

Tabla 1. Solución de problemas. Esta tabla resume los aspectos críticos, los errores comunes y las posibles soluciones durante el trabajo experimental.

Discussion

Hemos descrito la fabricación, la configuración experimental y los procedimientos de operación relacionados de un dispositivo PDMS microfluídico que contiene varios (PLBR) para el análisis unicelular de bacterias.

La microfabricación mediante técnicas de litografía blanda permite ajustes rápidos de las dimensiones del dispositivo para varios tamaños y morfologías de bacterias. Actualmente estamos optimizando el biorreactor de picolitros en cuanto al cultivo de diferentes organismos microbianos y el rendimiento del cultivo. Para aumentar la eficiencia de captura, también se está optimizando la geometría del reactor. La Figura 8 muestra cuatro nuevos dispositivos PLBR que están validados actualmente. En todas las figuras, el canal de siembra se rediseñó con respecto al ancho y la forma. En la práctica, esto parece tener un efecto en la cantidad de células que quedan atrapadas, pero necesita más investigaciones. También se lograron mejoras significativas con respecto a la eficiencia de captura mediante la incorporación de canales de desbordamiento adicionales que conducen a un mayor flujo conveccional a través del reactor y más células atrapadas. Sin embargo, al mismo tiempo aumenta el riesgo de lavar las células durante el cultivo.

El dispositivo es una alternativa interesante a los cultivos a macroescala que se han utilizado durante décadas para investigar los procesos de crecimiento y producción a nivel unicelular. Sin embargo, tiene algunos requisitos importantes: Para la monitorización paralela de varios biorreactores de picolitros, es obligatoria una configuración microscópica de alta resolución y totalmente motorizada con compensación de la deriva del foco. Además, se necesita un sistema de incubación para mantener constante la temperatura de cultivo deseada durante las mediciones.

Logramos una tasa de éxito del 95% en la fabricación de dispositivos. Los principales problemas están relacionados con la unión ineficiente de PDMS-vidrio, el colapso del techo PDMS o la fuga de fluido (consulte la Tabla 1 para la solución de problemas más frecuentes). Aunque el trabajo experimental se realiza parcialmente en condiciones no estériles, rara vez vemos contaminación durante los experimentos, debido al sistema fluídico cerrado. Los dispositivos microfluídicos PDMS son ópticamente transparentes, por lo tanto, se pueden utilizar para imágenes in vivo de alta resolución. Aunque PDMS parece ser perfecto para la aplicación, tiene una alta afinidad por las moléculas hidrofóbicas, lo que limita el uso de disolventes que se utilizan ampliamente en procesos biocatalíticos de células enteras. Sin embargo, existen recubrimientos adecuados para adaptar el protocolo a este tipo de aplicaciones.

El PLBR propuesto es muy adecuado para el análisis espacio-temporal de eventos celulares e incluso subcelulares de varios tipos de bacterias. Una ventaja importante del enfoque actual radica en la capacidad de cuantificar el crecimiento de microcolonias directamente en contraste con los métodos convencionales. Además, el PLBR permite el cultivo en condiciones definidas y constantes. Debido a que el sistema facilita el uso de pequeñas cantidades de reactivos o materiales, tiene las ventajas de ser económico, personalizable y susceptible de un alto rendimiento. En los métodos tradicionales, se consideran los valores promedio de toda la población al analizar el cultivo microbiano. Además, los métodos existentes necesitan un muestreo manual que puede provocar la degradación de las muestras y, por tanto, errores en la medición. El PLBR ofrece nuevas perspectivas para el desarrollo de bioprocesos y el análisis de heterogeneidad de poblaciones en microbiología. El PLBR es una herramienta prometedora para diversas aplicaciones dentro del desarrollo de bioprocesos y podría aplicarse en varios campos de investigación, por ejemplo, análisis de heterogeneidad de célula a célula, análisis de grupos celulares específicos dentro de linajes celulares, detección de cepas de producción microbiana e investigación en tiempo real de fenotipos celulares.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oblea de silicona de 100 mm de diámetro, P/BOR < 100>	Si-MAT, Materiales de silicio, Alemania
Fotorresistencia SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, Alemania
Fotorresistencia SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, Alemania
SU-8 Revelador mr DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH, Alemania
Polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 Kit	de elastómero de siliconaDow Corning; Farnell GmbH, Alemania
Agujas dosificadoras Puntas de precisión  27 G; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm	Nordson EFD Deutschland, Alemania
Placas de vidrio D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm	Schott AG, Alemania
Perforadora AKA 5130-B-90	Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm	Saint Gobain; VWR International GmbH, Alemania
Jeringas desechables – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Alemania	552-183143
Jeringas, 1 ml jeringas de vidrio estéril	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Alemania
Chemicals
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
Urea	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
MgSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
FeSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
MnSO4• H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
ZnSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
NiCl2• 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
Biotina	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
Ácido procatecuico	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
Glucosa-monohidrato	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania
BHI	Becton, Dickinson
Cells
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Alemania
Escherichia coli MG 1655	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Equipment
Limpiador de obleas SSEC 3300	Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
Alineador de mascarillas MA-6	Karl Suess
HP30A - 2	Torrey Pines Horno
Memmert UN 200	Memmert
Limpiador de plasma FEMTO	Diener Electronics, Alemania
Bombas de jeringa neMESYS	Cetoni GmbH, Alemania
Agitador magnético CB 162	Stuart	VWR 442-0304
Microscopio Nikon Eclipse Ti	Microscopía Nikon
	Pecon GmbH, Alemania
Centrífuga minispin plus " línea negra"	Fotómetro Eppendorf	9776501
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132000008
Agitador/incubadora de matraces 3031	GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, Alemania
Perfilómetro, Dektak 150 Stylus Profiler	Veeco