不活性ガスジェットを用いて接着した細胞の透過性
Summary
このプロトコルは、不活性ガスジェットを用いた接着細胞の一時的な透過化のための方法を記載している。この技術は、原形質膜を破壊する機械的な力を利用することにより接着性哺乳動物細胞への遺伝物質および生体分子の移動を容易にする。
Abstract
様々な細胞トランスフェクション技術が存在し、これらは3つのカテゴリーに分けることができます：ウイルス、化学的および機械的。このプロトコルは、時間的に細胞内に通常は非透過性の巨大分子の伝達を容易にすることができる不活性ガスジェットを用いて付着細胞を透過性にするための機械的方法を記載する。我々は、この技術は、マイクロポアの一時的な形成をもたらす、接着細胞の原形質膜上に剪断力を付与することによって機能すると考えている。これらの孔が作成されると、次いで、細胞を遺伝物質および他の生体分子に対して透過性である。関係する機械的な力は、その基板から完全に損傷または取り外し細胞のリスクを実行します。技術が有効である不活性気体力学の狭い範囲は、したがって、存在する。不活性ガスジェットは、HeLa、HEK293およびヒト腹部大動脈内皮細胞を含む種々の接着性細胞株を効率的に透過性であることが証明されている。このプロトコルは、Pに適しています我々は、研究のために、潜在的に将来の臨床用途に使用することができる示し、 インビボで実証したように、両方のin vitroでの接着細胞のermeabilizationと、。また、貴重な研究ツールであることを証明する可能性が、空間的に限定的に細胞を透過性という利点があります。
Introduction
生物医学の進化と細胞の力学を理解し、細胞への生体分子の送達は、多くの研究分野や医学療法に不可欠となっています。異なる技術は、原形質膜を通って細胞サイトゾル内に外来分子を導入するために開発されてきた。ウイルス、化学的または機械的技術：これらは一般的にのいずれかとして分類することができる。ウイルス技術は、ウイルスベクター1を用いたRNAやDNAなどの遺伝物質をトランスフェクトすることができる。ウイルス技術は、しかしながら、それらは免疫および炎症反応の2の可能性を持っている、ある種の細胞株において高い効率を有する傾向がある。一般的な化学的トランスフェクション法は、リン酸カルシウム3、細菌外毒素4とリポフェクション5での沈殿が含まれています。これらの技術は有効であることが証明されているが、特定の問題は、細胞毒性および非特異性として生じる。さらに、このようなカルシウムのような技術phosphat電子沈殿はほとんどの初代細胞6に、最大70％までしか特定の細胞株においてトランスフェクション効率を有することが見出されている。これは、特に臨床用途およびDNAの機能の研究のための様々な治療を設計する場合には、一次細胞中に入れられている研究努力を増大させるように注目すべきである。
機械的刺激を介して細胞膜の一時的な破壊は、細胞に外来分子を導入するための代替手段である。技法としては、分子が7のマイクロインジェクション、膜8,9を破壊電界を用いてエレクトロポレーション、ソノポレーションが結合した粒子を撮影する「遺伝子銃」によって示されるように、細胞膜10-12、粒子ボンバードメントを破壊するために超音波を使用してセル13への遺伝子、およびより最近では、時間的に哺乳動物細胞を14,15を透過することが示されている流体せん断応力を印加する。メカニックもののらの方法は、前述の問題の一部を回避するため、それらは一般的に低い効率と、非常に複雑で専門的なセットアップを伴う。大気圧グロー放電トーチ（APGD-T）は、表面を機能化し、インビトロ 16 に付着した細胞を剥離の初期目標にマギルで開発されました。偶然、それが使用されている生/死染色は、何らかの形で浸透化剤が添加されずに細胞に取り込まれていたことが発見されました。さらに、これが唯一のトーチ·パスと一致するように起こった井戸の制限区域で発生しているように見えた。 APGD-tは透過処理能力の調査を継続し、コントロール研究においては、励起することなく、プラズマの不活性キャリアガスジェットはまた、細胞を透過することができたことがわかった。これは、プラズマジェットによって作成された反応種を一時的に膜の機能を損なわ初期仮説に矛盾を提示単にそのmechani校正力は、細胞透過を引き起こすのに十分であった。ここから、研究は試してみて、定量化し、透過処理、不活性ガスジェットの効率だけでなく、そのトランスフェクション能力16を見て特徴づけるために私たちの研究室で継続。
これらの研究を通して、それは微細孔が原形質膜における実際の形で行うことが見出されており、これらの孔は、約5〜15秒以内に再密封する傾向がある。我々は、ニワトリ胚の漿尿膜のin vitroおよびin vivoでの技術の有用性を実証した。
Protocol
Representative Results
Discussion
不活性ガスジェット透過化は、付着細胞のトランスフェクションのために有用な技術である。これは、潜在的に有害な化学物質又はウイルスベクターの必要性を排除する機械的な力の使用で細胞に生体分子を転送する能力を提供する。技術は、潜在的に研究者や臨床医に正確に細胞をトランスフェクトするための効率的かつ比較的簡単な方法を与えることができる。透過化の選択性はまた、?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
カナダ衛生研究所（CIHR）、自然科学と工学研究評議会（NSERC）：著者は、次の資金源に感謝したいと思います。
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
Referencias
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