Complejos de proteínas con múltiples componentes juegan un papel crucial durante la función y el desarrollo celular. Aquí se describe un método usado para aislar los complejos de proteínas nativas a partir de embriones de Drosophila después de la reticulación en vivo seguido de la purificación de los complejos reticulados para el análisis de estructura-función subsiguiente.
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Artículo de método
Un In vivo Enfoque de reticulación para aislar Complejos de Proteína Desde Drosophila Los embriones
En este artículo
Resumen
Resumen
Muchos procesos celulares están controlados por complejos de proteínas con múltiples subunidades. Frecuentemente, estos complejos se forman transitoriamente y requieren entorno nativo de montar. Por lo tanto, para identificar estos complejos de proteínas funcionales, es importante para estabilizar ellos in vivo antes de la lisis celular y la posterior purificación. Aquí se describe un método para aislar grandes complejos de proteínas de buena fe a partir de embriones de Drosophila. Este método se basa en la permeabilización del embrión y la estabilización de los complejos dentro de los embriones de reticulación en vivo usando una baja concentración de formaldehído, que puede atravesar fácilmente la membrana celular. Posteriormente, el complejo proteína de interés se inmunopurificó seguido por purificación en gel y se analizaron por espectrometría de masas. Se ilustra este método mediante la purificación de un complejo de proteínas de Tudor, que es esencial para el desarrollo de la línea germinal. Tudor es una proteína grande, que contiene varios dominios Tudor - pequeñamódulos que interactúan con argininas metiladas o lisinas de las proteínas diana. Este método puede adaptarse para el aislamiento de complejos de proteínas nativas de diferentes organismos y tejidos.
Introducción
El aislamiento de las asambleas de proteínas y complejos de múltiples subunidades de ADN o ARN-proteína se realiza para identificar los complejos de proteínas, genómica loci reconocida por proteínas reguladoras se unen al ADN o ARN objetivos de las proteínas de unión de ARN. Diferentes métodos permiten la identificación de todo el genoma de ADN sitios reconocidos por factores de transcripción o proteínas de la cromatina (ChIP-seq) 1 y los objetivos de ARN asociados con una proteína de unión al ARN dado (CLIP-seq) 2. Las bibliotecas de ADNc de ARN derivados u objetivos de ADN son entonces profundamente secuenciados. Estos métodos utilizan química....
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Protocolo
1. Preparación grandes de Apple Juice Placas de agar
- Para hacer 4 platos, añadir 375 ml de H2O, 11,25 g de agar con mosca y una barra de agitación en un matraz de 1000 ml. Se trata de Mix A. Autoclave Mix A con la tapa frasco sin apretar tope en un ciclo de 30 min-esterilización para productos líquidos.
- Añadir 125 ml de jugo de manzana, 12,5 g azúcar de mesa y una barra de agitación a un vaso de 500 ml. Esta es la mezcla B. El calor de la mezcla B en una plataforma calentada mientras se agitaba y mantener la temperatura a aproximadamente 70 ° C hasta que se terminó el tratamiento en autoclave de la mezcla A.
- Tras la finalizac....
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Resultados
La eficacia de la reticulación y la purificación con éxito del complejo de la proteína reticulada Tud se analizaron por SDS-PAGE en un 3% - 7% de gel de paso (ilustrado en la Figura 1), seguido de Western blot (Figura 2).
El propósito de utilizar el 3% - gel de paso 7% se basa en la separación efectiva de reticulado complejo de proteínas Tud de la proteína Tud no reticulada restante y la concentración del complejo. Bajo nuestras condiciones in vivo .......
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Discusión
El formaldehído se ha usado comúnmente como un reactivo de reticulación para la identificación de proteína-proteína y las interacciones proteína-ácido nucleico. Su buena solubilidad y permeabilidad de la membrana celular, junto con la compatibilidad con los procedimientos de espectrometría de masas aguas abajo, crea formaldehído un agente candidato ideal para aplicaciones de reticulación intracelulares 3,15-17. En particular, se utiliza con éxito para identificar los ARNm asociados con Vasa, una helicasa de A.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler y Jimiao Zheng por su ayuda técnica con este estudio. Este trabajo fue apoyado por NSF CARRERA conceder MCB-1054962 de ALA
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | No autoclave la mezcla de agua y agar durante un período prolongado de tiempo, ya que hará que los platos de jugo de manzana se vuelvan frágiles |
| 4-hidroxibenzoato de metilo | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Otro nombre: TEGOSEPT |
| Jaula de población | Materia mosca ( http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Malla de nailon fino | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | Al hacer la cesta de recolección, corte la malla un poco más grande que la abertura de la tapa del tubo de halcón para asegurar un sellado hermético |
| Homogeneizador Dounce | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Enfríe el homogeneizador con hielo y enjuague previamente con tampón de lisis en frío antes de usar para evitar la degradación de proteínas |
| . | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS podría usarse para preparar una solución madre concentrada de inhibidores de proteasa |
| Perlas de agarosa anti-HA | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | El kit también incluye péptido de HA y columnas de centrifugación |
| Péptido de HA | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare para 2 mg / ml con PBS |
| Columna de centrifugado | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Las columnas de centrifugado están incluidas como parte del kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | ||
| Tritón X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Diluir de 10X a 1X con agua nanopura antes de usar |
| formaldehído | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glicina | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Fluoruro de fenilmetanosulfonilo | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM de solución madre en isopropanol y luego diluya hasta una concentración de trabajo de 2 mM en tampón de lisis |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| Tubos de 15 ml | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Lejía | marca | Diluir con igual volumen de agua nanopura para hacer lejía al 50% | |
| Tubos de 50 ml | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Tamiz de capa superior | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Tamiz de capa inferior | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
Referencias
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Meth....
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Reimpresiones y permisos
