La telomerasa se expresa en el cerebro neonatal y también en distintas regiones del cerebro adulto. Presentamos un ensayo TRAP no tóxico que ahorra tiempo para el análisis de la actividad de la telomerasa en varias regiones del cerebro del ratón y la detección de diferencias en la actividad de la telomerasa entre los cerebros de ratones machos y hembras.
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Artículo de método
Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo
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Resumen
Resumen
La telomerasa, una ribonucleoproteína, es responsable de mantener la longitud de los telómeros y por lo tanto la promoción de la integridad genómica, la proliferación, y la vida útil. Además, la telomerasa protege la mitocondria de estrés oxidativo y confiere resistencia a la apoptosis, lo que sugiere su posible importancia para el sobreviviente de la no-mitótico, las células altamente activos, tales como neuronas. Hemos demostrado previamente la capacidad de los nuevos activadores de telomerasa para aumentar la actividad y la expresión de la telomerasa en las diversas regiones de cerebro de ratón y para proteger a las células neuronas motoras del estrés oxidativo. Estos resultados refuerzan la noción de que la telomerasa está implicado en la protección de las neuronas de diversas lesiones. Para subrayar el papel de la telomerasa en el cerebro, que aquí comparamos la actividad de la telomerasa en el cerebro de ratones macho y hembra y su dependencia de la edad. Ensayo TRAP es un método estándar para la detección de actividad de la telomerasa en varios tejidos o líneas celulares. Aquí se demuestra el anásis de la actividad de la telomerasa en tres regiones del cerebro de ratón por no desnaturalizante de extracción de proteínas utilizando CHAPS tampón de lisis seguido por modificación del ensayo TRAP estándar.
En este ensayo de 2 pasos, la telomerasa endógena se alarga un sustrato específico de la telomerasa (cebador TS) mediante la adición de 6 repeticiones TTAGGG pb (reacción de la telomerasa). Los productos de reacción de telomerasa se amplifican por reacción PCR crear una escalera de ADN de incrementos de 6 pb. El análisis de la escalera de ADN se realizó por electroforesis en gel de agarosa de alta resolución 4,5% seguido de tinción con colorante de ácidos nucleicos altamente sensibles.
En comparación con el ensayo TRAP tradicional que utilizan marcado con 32P radiactivo dCTP de para la detección de ADN y la electroforesis en gel de poliacrilamida para la resolución de la escalera del ADN, este protocolo ofrece un ahorro de ensayo TRAP para evaluar la actividad de la telomerasa en el cerebro del ratón, lo que demuestra la capacidad de tiempo no tóxica detectar diferencias en telomerasactividad de correo en los distintos región del cerebro del ratón hembra y macho.
Introducción
La telomerasa es una ribonucleoproteína compuesta de la telomerasa transcriptasa inversa (terc), la subunidad catalítica de la telomerasa, y un componente de ARN (TERC). El papel canónica de la telomerasa es preservar la longitud adecuada de los telómeros mediante la adición de secuencias repetitivas (TTAGGG) a los extremos teloméricas, por lo tanto, la promoción de la integridad genómica, y la proliferación celular 1. Funciones adicionales se atribuyeron a de TERT en células, es decir, que confiere resistencia a la inducida por diversos agente que daña el 2 apoptosis, protege a las células madre mesenquimatosas humanas del estrés oxida....
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Protocolo
Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la experimentación con animales en la Universidad Ben-Gurion (IL-39-08-2010).
1. ratón Cerebro Proteína Extracción
- Preparar 3 tubos de 15 ml cada una que contienen tubos de 5 ml de solución de Ringer y colocar en hielo.
- Sacrificar el ratón usando anestesia isoflurano (PRECAUCIÓN - Utilizar campana química) durante 10-20 segundos, seguido por dislocación cervical y decapitación inmediata.
- Retire el cerebro del cráneo y enjuague durante unos segundos con una solución helada de Ringer para evitar daños en el tejido cerebral.
- Usan....
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Resultados
Extractos de proteínas de células enteras se han preparado desde el lóbulo frontal (FL), el tronco cerebral (BS) y el cerebelo (CR), derivado de 3 mujeres y 3 CD-1 ratones macho-1 CD en las edades de 1 y 3 meses de edad para la ensayo TRAP modificado y 3 CD-1 ratones machos a la edad de 2 meses de edad para el ensayo TRAP radiactivo. Actividad de la telomerasa se detectó en 1 mg de extracto de proteínas usando el ensayo TRAP modificado y 2 mg extracto de proteínas para el ensayo TRAP radiactivo. La detección de activida.......
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Discusión
Análisis de la actividad de la telomerasa en el cerebro del ratón a través de la trampa de ensayo consiste en 4 pasos principales: 1) proteínas de extracción a partir de regiones específicas del tejido cerebral 2) TS de elongación de iniciador de telomerasa por - reacción de la telomerasa 3) amplificación de los productos de reacción de telomerasa mediante PCR 4 ) separación de los productos de PCR usando gel de agarosa de alta resolución.
Este ensayo TRAP modificado aborda dos grandes dific.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente apoyado por la tecnología de B.G. Negev y la contribución de Linda Powers.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| TRAP Mix (10x) | Hecho manualmente, mezcle lo siguiente en UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (comprado en Sigma). Las alícuotas se congelan a -20 °C. | ||
| de Ringer | Hecho manualmente, mezcle lo siguiente en DDW: 124 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 1.25 mM de NaH2PO4· H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L D-(+)-glucosa anhidra. | ||
| Isoflurano | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Manéjelo con cuidado en una cubierta química |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos ordenados en formato DRY y UPW añadidos según la concentración requerida | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos ordenados en formato DRY y UPW añadidos según el requierd concentración | |
| Titanio Taq Polimerasa/Tampón | Clontech | S1792/S1793 | |
| Agarosa de alta resolución | Sigma | A4718 | Cualquier agarosa de alta resolución de alta calidad puede ser utilizable |
| Aparato de mini-gel | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Tinción de ácido nucleico (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | ordenados en formato DRY y UPW añadidos según la concentración requerida | |
| Tampón de lisis CHAPS | Tecnología de señalización celular | 9852S | Agregue PMSF (inhibidor de la proteasa) a una concentración final de 1 mM |
| Agua ultrapura (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| Ratones CD-1 | HARLAN Laboratories INC. |
Referencias
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by nove....
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Reimpresiones y permisos
