طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري
Summary
التقنيات التقليدية لتصنيع بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية التي تحتوي على تحقيقات الفلورسنت تتضمن يقحم هلام بين سطح ملتصقة وشريحة زجاجية. هنا، وتبين لنا أن هذه الشريحة مع طلاء بولي-D-يسين (PDL) وتحقيقات الفلورسنت يموضع تحقيقات في حدود 1.6 ميكرون من سطح هلام.
Abstract
ولطالما استخدمت المواد الهلامية السلطة الفلسطينية كمنصة لدراسة قوات الجر الخلية بسبب سهولة تصنيع والقدرة على ضبط خصائصها المرنة. عند الركيزة المغلفة مع بروتين المصفوفة خارج الخلية، وخلايا تلتزم جل وتنطبق القوات، مما تسبب في هلام لتشويه. تشوه يعتمد على الجر الخلية وخصائص المرونة من هلام. إذا كان من المعروف مجال تشوه السطح، سطح الجر يمكن حسابها باستخدام نظرية مرونة. يتم قياس هلام تشوه عادة عن طريق دمج الخرز علامة فلوري بشكل موحد في هلام. تحقيقات تهجير ويشوه هلام. يتم تعقب تحقيقات بالقرب من سطح هلام. تعتبر النزوح التي أبلغ عنها هذه التحقيقات والتشريد السطح. يتم تجاهل أعماقها من السطح. يقدم هذا الافتراض خطأ في التقييمات قوة الجر. لقياس الدقيق للقوات خلية، من المهم جدا للموقع من الخرز ليكون معروفا. طورناوهي تقنية تستخدم الكيمياء بسيط لحصر الخرز علامة فلوري، 0.1 و 1 ميكرون في القطر، والمواد الهلامية في السلطة الفلسطينية، ضمن 1.6 ميكرون من السطح. نحن معطف ساترة مع بولي-D-يسين (PDL) والخرز الفلورسنت. ثم محصورة بين السلطة الفلسطينية حل هلام ساترة وسطح ملتصقة. نقل حبات الفلورسنت إلى حل خلال هلام علاج. بعد البلمرة، PA هلام يحتوي على حبات الفلورسنت على مقربة الطائرة إلى سطح هلام.
Introduction
وعادة يتم دراستها التفاعل الميكانيكي للخلية الحية مع البيئة المحلية في استخدام المواد الهلامية السلطة الفلسطينية. هذه تعتمد على ركائز بسيط، بروتوكول جيدا اتسم أنشأها ديمبو وانغ في عام 1997 1. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه ركائز هو أن صلابة بهم يمكن ضبطها عن طريق تعديل تركيزات مكونات محددة من الحل هلام. وهذا يوفر منصة مرغوبة لدراسة تفاعل الخلايا مع بيئات مختلفة من الجمود. عندما المواد الهلامية المغلفة السلطة الفلسطينية مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات، والخلايا التمسك بها، وتوليد القوة. نتيجة لقوة الخلية، وهلام يشوه كهيئة مرن. هذا التشوه يعتمد على مقدار القوة التي تطبقها الخلايا وخصائص المرونة من هلام. وقد استخدمت العديد من الدراسات والمواد الهلامية السلطة الفلسطينية للتحقيق في قوات الجر الخلوية.
الاختلاف في واحدة من السلطة الفلسطينية هلام تلفيق، هي جزء لا يتجزأ المجهرية الفلورسنت (الخرز) رالاحجار الكريمه هلام لقياس قوات الجر خلية في المواد الهلامية من الجمود مختلفة 2. بناء على طلب قوة الخلية، وحبات تهجير من موقع الأولي في أعقاب هلام تشوه. يتم قياس مجال تشوه من التشريد حبة الفردية. ويستخدم هذا المجال تشوه مع نظرية المرونة وخصائص المرونة من هلام لحساب القوات الجر. توفر هذه القياسات فكرة عن كيفية الخلايا ميكانيكيا الشعور والتفاعل مع المكروية المحلية 3.
في العديد من بروتوكولات السلطة الفلسطينية هلام تلفيق المستخدمة على نطاق واسع، واختلطت حبات في جميع أنحاء هلام السلطة الفلسطينية في السائل، وحالته unpolymerized. جل بلمرة تماما PA يحتوي على حبات الفلورسنت طوال حجمه. عند حساب قوى الجر الخلية، ويتم مراقبة الخرز الأكثر بالقرب من سطح هلام (واجهة الخلية الركيزة). ويفترض أن النزوح من هذه الخرز تحدث على سطح خلية للثقافة البساطة في calculatio القوةن. وتجاهل الموقع الفعلي من الخرز داخل عمق هلام. ومع ذلك، في وسيلة مرنة (مثل هلام PA)، حبة أقرب إلى نقطة تطبيق القوة ستتحرك أكثر من حبة وهذا هو أبعد من هذه النقطة. وبالتالي، علاج تشريد نقطة (في الموقع حبة) البعيدة من السطح كما انه في نتائج السطحية في التقليل من tractions الخلوية. درجة الخطأ تعتمد على المسافة من حبة من السطح. لا يمكن تقدير الخطأ من دون معرفة مكان وجود حبة.
لقد تم تناول الحاجة إلى طريقة بسيطة لحصر الخرز جدا بالقرب من سطح خلية ثقافة ببضعة التقنيات. طريقة واحدة هي زيادة كثافة الخرز طوال هلام كله مثل أن هناك عددا كافيا من الخرز في الطائرة التنسيق العليا لقياس الحركة قريبة جدا من السطح. أسلوب آخر ينطوي على بناء غرفة التصوير مبائر للتصوير الخلايا الحية بحيث الضوء منفقط حبات في الطائرة العلوي الأكثر الوصل يتم جمع 4. يتضمن طريقة مختلفة تتراكب طبقة رقيقة جدا من هلام السلطة الفلسطينية تحتوي على الخرز على رأس هلام بلمرة بالفعل دون الخرز 5. والعيب كل من هذه التقنيات هو أن الموقع الدقيق من الخرز داخل هلام غير معروف. هذا الخطأ يدخل في حساب مجال النزوح من الخرز، وبالتالي حساب القوات الخلية. أسلوب آخر ينطوي على الاقتران من الخرز إلى السطح العلوي من هلام السلطة الفلسطينية بلمرة بالفعل باستخدام سلفو-SANPAH 6. هذا الأسلوب يضمن الخرز هي في الواقع إلا على الجزء العلوي من هلام السلطة الفلسطينية، ولكن إلى أي مدى هي جزء لا يتجزأ في عمق هلام غير معروف. هذا يحتمل أن إنشاء الطبوغرافيا المحلية للخلايا، والتي يمكن أن تغير سلوك الخلية، كما اقترح العمل قبل أن الخلايا يمكن الشعور بالقوة عدة ميكرون بعيدا 7. مؤخرا، وهي تقنية لالزخرفة المواد الهلامية السلطة الفلسطينية مع 1 ميكرون القطر وتأسست luorescent فبرونيكتين نقطة علامات في مجموعة وقننت 8. في هذه الحالة، وعمق من علامات الفلورسنت هو معروف، وأساسا الصفر، كما تتم طباعة نمط فبرونيكتين غير مباشرة على سطح هلام. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لا توفر بيئة مستمرة على الخلايا التي يمكن أن نعلق، والبروتين ECM يقتصر على 1 ميكرومتر النقاط القطر. لم يتم بعد تأسيس طريقة لدمج الخرز بالكامل تعقب المواد الهلامية داخل السلطة الفلسطينية وقصر بعضها إلى موقع معروف جدا بالقرب من السطح.
هنا، ونحن نطور تقنية لتقييد ميكرون الفرعي إلى قطرها ميكرون الخرز الفلورسنت إلى المستوى البؤري جدا بالقرب من سطح الثقافة خلية داخل هلام السلطة الفلسطينية. عادة يتم الشفاء جل بواسطة يقحم unpolymerized حل هلام السائل بين لوحين من الزجاج. واحدة من لوحات وبين functionalized بحيث هلام تتمسك بشدة لذلك. والآخر هو unfunctionalized وتتم إزالة بعد علاج هلام. نقوم بتعديل هذا الزجاج قابل للإزالة سوrface بواسطة طلاء بطبقة من الخرز. على يقحم الجل السائل بين بين functionalized وحبة المغلفة سطح الزجاج، ونقل الخرز إلى هلام في حين أنه هو علاج. وهذا يحد من مسافة التكامل الخرز "في هلام في 1.6 ميكرون من السطح. تستخدم الأطباق الزجاجية القاع بيتري على سطح ملتصقة الذي يتم علاجه هلام. لتشكيل السطح العلوي هلام شقة خلال البلمرة، يتم استخدام غطاء زجاجي دائري زلة لشطيرة هلام مع طبق بتري الزجاج السفلي. قبل تلفيق هلام، وهي مغلفة زجاج الغطاء العلوي زلة مع بولي-D-يسين (PDL)، مما أسفر عن تهمة سطح إيجابي. نفخ في PDL قبالة مع الهواء المضغوط، ويترسب حل من الخرز في الماء على زلات الغطاء. نحن نستخدم بلي الفلورسنت carboxylated، التي تحمل شحنة سالبة، والتفاعل مع سطح موجبة الشحنة التي أنشأتها العلاج مع PDL. بعد تهب الحل حبة قبالة ساترة مع الهواء المضغوط، وطبقة واحدة منحبات تبقى مقرونة كهربية لتغطية زلة الجاف. طلاء PDL لا يؤثر على الإلتصاق من الزجاج على سطح هلام، والشرائح الزجاجية غير تالفة وإزالتها من هلام PA سليمة تماما.
مصنوعة من الزجاج أطباق بتري السفلي ملتصقة عن طريق العلاج مع 97٪ 3 أمينو بروبيل-trimethoxysliane و 0.5٪ غلوتارالدهيد. يتم إنشاء المواد الهلامية السلطة الفلسطينية من الجمود المطلوب عن طريق خلط تركيزات مناسبة من bisacrylamide والأكريلاميد عن طريق الإجراء القياسي 9. وpipetted قطرات من الحل الهلام على طبق بتري الزجاج السفلي. يتم استخدام زلة غطاء زجاجي يحتوي على حبات لشطيرة الجل مع طبق بيتري. عندما يتم الشفاء هلام، يتم إزالة الغطاء العلوي زلة تاركا جزءا لا يتجزأ من الخرز في هلام داخل السلطة الفلسطينية 1.6 ميكرون من السطح.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند استخدام هذه التقنية، فمن الضروري أن الحل حبة وتضعف بشكل صحيح ويتم اختيار حبات بناء على القطر المطلوب، PA هلام الركيزة وصلابة، وحجم حجم الظواهر التي تم استكشافها في التجربة المطلوبة.
وينبغي اتخاذ الحذر عند تمييع الحل حبة قبل fun…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن نعترف برنامج مبادرة التخصصات الابتكار، جامعة إلينوي، منح 12035. وقد تم تمويل SK في UIUC من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) منحة 0965918 IGERT: تدريب الجيل القادم من الباحثين في الخلوية والجزيئية وميكانيكا BioNanotechnology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
Referencias
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. . Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).
