Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

Resumen

Las técnicas tradicionales para la fabricación de poliacrilamida (PA) geles que contienen sondas fluorescentes implican intercalando un gel entre una superficie adherente y un portaobjetos de vidrio. Aquí, mostramos que el revestimiento de esta diapositiva con poli-D-lisina (PDL) y sondas fluorescentes localiza las sondas dentro de 1,6 m de la superficie del gel.

Resumen

Geles de PA han sido utilizados como plataforma para estudiar las fuerzas de tracción de células debido a la facilidad de fabricación y la capacidad de sintonizar sus propiedades elásticas. Cuando el sustrato se recubre con una proteína de la matriz extracelular, las células se adhieren al gel y se aplican fuerzas, haciendo que el gel se deforme. La deformación depende de la tracción celular y las propiedades elásticas del gel. Si se conoce el campo de deformación de la superficie, la superficie de tracción puede calcularse utilizando la teoría de la elasticidad. La deformación del gel se mide comúnmente mediante la incorporación de perlas de marcador fluorescente de manera uniforme en el gel. Las sondas desplazan como el gel se deforma. Las sondas cerca de la superficie del gel se realiza un seguimiento. Los desplazamientos reportados por estas sondas se consideran como desplazamientos de superficie. Se ignoran sus profundidades desde la superficie. Esta suposición introduce un error en la evaluación de la fuerza de tracción. Para la medición precisa de las fuerzas de células, es crítico para la ubicación de las perlas para ser conocida. Hemos desarrolladouna técnica que utiliza la química sencilla para confinar perlas de marcadores fluorescentes, 0,1 y 1 m de diámetro, en geles de PA, dentro de 1,6 m de la superficie. Nos capa de un cubreobjetos con poli-D-lisina (PDL) y perlas fluorescentes. PA solución de gel se intercala después entre el cubreobjetos y una superficie adherente. Las perlas fluorescentes se transfieren a la solución de gel durante el curado. Después de la polimerización, el gel PA contiene perlas fluorescentes en un plano cerca de la superficie del gel.

Introducción

La interacción mecánica de una célula viva con su medio ambiente local comúnmente se ha estudiado el uso de geles PA. Estos sustratos se basan en un protocolo simple, bien caracterizado establecido por Dembo y Wang en 1997 ^1. Una de las principales ventajas de estos sustratos es que su rigidez puede ser sintonizada mediante la modificación de las concentraciones de los componentes específicos de la solución de gel. Esto proporciona una plataforma conveniente para estudiar la interacción células con ambientes de diferentes rigideces. Cuando geles PA se recubren con la matriz extracelular (ECM), las proteínas, las células se adhieren a ellos, la generación d....

Protocolo

La fabricación de geles y funcionalización PA de diferente rigidez con microesferas fluorescentes incrustados cerca de la superficie de cultivo de células.

1. funcionalizar los Cubreobjetos Top Glass

1. Limpie cubreobjetos de vidrio (# 1.0, 12 mm diam.) Con agua y jabón, seguido de etanol para eliminar el polvo extraño.
2. Coloque la cubierta de vidrio se desliza en un (es decir, soporte de punta de pipeta) superficie de rallado de tal manera que no se toquen para facilitar la facilidad de interacción con los cubreobjetos.
3. Escudo toda la superficie de la cubierta se desliza con poli-D-lisina (0,1 mg / ml)....

Resultados

Confocal de imágenes se utilizó para determinar que las perlas eran de hecho por debajo de la superficie del gel y para cuantificar su ubicación precisa dentro de la profundidad de gel. Perlas fluorescentes de una longitud de onda diferente que aquellos en el interior del gel se dejaron sedimentar en la superficie, y la distancia entre las nanopartículas fluorescentes embebidos y los de la superficie se calculó utilizando un algoritmo de identificación centroide. La ubicación del talón sobre la superficie del gel sirve .......

Discusión

Cuando se utiliza esta técnica, es esencial que la solución de bolas se diluye apropiadamente y las perlas se eligen basándose en diámetro deseado, PA rigidez sustrato gel, y la escala de tamaño de los fenómenos que se explora en el experimento deseado.

Se debe tener cuidado al diluir la solución del grano antes de la funcionalización de los mejores cubreobjetos de vidrio. La separación entre los granos en la superficie del gel puede ser alterado cambiando el factor de dilución de la solució.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
97% 3-Aminopropil-trimetoxisliano (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehído	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M solución tampón HEPES	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrilamida	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrilamida	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µ m Microesferas fluorescentes (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectina, Humano, 1 mg	BD Biosciences	354008
Persulfato de amonio	Bio-RAD	161-0700
Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poli-D-lisina	Millipore	A-003-E
Clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hidroxisulfosuccinimida (NHS)	Thermo Scientific	24500
0,05% Tripsina-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Ácido acrílico	Sigma-Aldrich	147230
Glicerol	Sigma-Aldrich	G7757
Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materiales
35 mm Plato de fondo de vidrio con micropocillo de 14 mm #1 cubreobjetos	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Cubreobjetos de vidrio, 12 mm de diámetro.	Ted Pella, Inc.	26023