Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix
Summary
Celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een overvloed aan fysiologische, zoals wondgenezing en immuunreacties en pathofysiologische processen, zoals kanker. De 3D-matrix van collageen migratie assay is een veelzijdig instrument om de trekkende eigenschappen van verschillende celtypes te analyseren binnen in een 3D-fysiologische-achtige omgeving.
Abstract
Het vermogen om te migreren is een kenmerk van verschillende celtypes en speelt een cruciale rol in verscheidene fysiologische processen, zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing, en immuunresponsen. Echter, celmigratie is ook een belangrijk mechanisme bij kanker waarmee dit kankercellen los van de primaire tumor metastatische verspreiding starten. In de afgelopen jaren verschillende celmigratie assays ontwikkeld om het migratiegedrag van verschillende celtypen analyseren. Omdat het motorisch gedrag van cellen sterk verschilt tussen een tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) omgeving kan worden aangenomen dat de analyse van de migratie van cellen die zijn ingebed in een 3D omgeving oplevert in significantere celmigratie data. Het voordeel van de beschreven 3D collageenmatrix migratietestsysteem is dat cellen worden ingebed bij een fysiologische 3D netwerk van collageenvezels die de belangrijkste component van de extracellulaire matrix. Doortime-lapse microscopie video real celmigratie gemeten waarbij het bepalen van verschillende migratieparameters en hun veranderingen in reactie op pro-trekkende factoren of remmers. Verschillende celtypes kunnen worden geanalyseerd met deze techniek, waaronder lymfocyten / leukocyten, stamcellen en tumorcellen. Evenzo kan ook celgroepen of bolvormige deeltjes worden ingebed in de collageen matrix gelijktijdig met de analyse van de emigratie van enkele cellen uit de cel cluster / spheroid in de collageen rooster. We concluderen dat de 3D collageenmatrix migratie assay is een veelzijdige methode om de migratie van cellen te analyseren in een fysiologisch-achtige 3D-omgeving.
Introduction
Like celfusie (voor een overzicht zie 1,2) celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een grote verscheidenheid aan fysiologische processen zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing en immuunresponsen (voor review zie 3). Echter, het vermogen om te migreren is een voorwaarde voor tumorcellen uitzaaien (voor review zie 3,4).
Cel migratie een complex, nog volledig begrepen proces dat wordt geleid door de wisselwerking van verschillende signaaltransductieroutes geïnitieerd door verschillende ligand (bijvoorbeeld cytokines, chemokines, groeifactoren, hormonen, extracellulaire matrixcomponenten) receptor (bijvoorbeeld receptor tyrosine kinases, chemokine-receptoren, integrines) interacties 5 uiteindelijk veroorzakend de reorganisatie van het actine cytoskelet gelijktijdig met de- en hermontage van focale adhesie complexen en integrine-gemedieerde signalering 6.
<p class = "jove_content"> celmigratie verschillende in vitro es in vivo celmigratie testen analyseren ontwikkeld in de afgelopen jaren, met inbegrip van de Boyden kamer / transwell assay 7, scratch test / wondgenezende assay 8-10, drie-dimensionale ( 3D) collageenmatrix migratie assay 11 evenals intravitale beeldvorming / microscopie (voor een overzicht zie 12). Elk van deze cel migratie assays heeft voor-en nadelen, bijvoorbeeld met betrekking tot de kosten en de behoefte van de apparatuur, het hanteren of de betrouwbaarheid van de verkregen gegevens.Zowel de Boyden kamer / transwell test en de scratch test / wondgenezende assay gemakkelijk, goedkoop en goed ontwikkelde assays celmigratie gemeten in vitro 7-10. In de Boyden kamer / transwell assay cellen worden bovenop een insert met poriën (ongeveer 8 micrometer in diameter) – de zogenaamde bovenste compartiment 7. Optioneel, kan het inzetstuk worden bekleed met extracellulaire matrix componenten, bijvoorbeeld fibronectine, collageen, etc., om een fysiologische omgeving nabootsen. Evenzo kan endotheelcellen worden gekweekt boven het inzetstuk, waardoor een endotheliale barrière 13 nabootsen. Die cellen die gedurende een bepaalde tijdsinterval in het onderste compartiment herbergen media en supplementen, zoals groeifactoren en chemokinen doorgegeven via de poriën, worden gebruikt als een uitlezing celmigratie (of extravasatie) kwantificeren.
In de scratch test / wondgenezing assay cellen worden gezaaid in platen en zijn uitgegroeid tot samenvloeiing 10. In afhankelijkheid van de experimentele setting platen kunnen vooraf worden bekleed met extracellulaire matrixcomponenten, zoals fibronectine. Nadat een kras / ontbonden door schrapen celmonolaag enkele cellen van elke kant van de kras / wond kan migreren in de spleet, waardoor het vullen / genezing te 10. De afstand tussen de twee kanten van de kras / wonden wordt bepaaldafhankelijk van de tijd en wordt gebruikt als een uitlezing voor het trekkende activiteit van de cellen 10. Echter, onderscheid maken tussen celproliferatie (die ook kan leiden tot het vullen / genezing van de kras / wond) en celmigratie wordt aanbevolen de assay te combineren met time-lapse microscopie en video cel volgen 10.
Zowel de Boyden kamer / transwell test en scratch test / wondgenezende assay, zijn eerder onvolmaakte over een fysiologische-achtige cellulaire omgeving. In de Boyden kamer / transwell assay cellen migreren door een plastic porie, terwijl in de scratch test / wondgenezende assay cellen worden op een twee-dimensionale pre-gecoate kunststoffen plaat. Zo wordt ook goed ingezien dat het migratiegedrag aanzienlijk verschilt tussen een tweedimensionale en 3D-omgeving 3. Bijvoorbeeld, drie-dimensionale matrix adhesies fibroblasten verschillen van focale adhesies fibrillair kenmerkt tweedimensionale substraten in de inhoud van α5β1 en avß3 integrines, paxillin, andere cytoskelet componenten, en tyrosine fosforylering van focal adhesion kinase 14. Evenzo cellen ingebed in een 3D-omgeving getoond ook een veranderde migratiegedrag 15. Aldus celmigratie analyse nauwkeuriger een migratietestsysteem wordt aanbevolen zodat de migratie van afzonderlijke cellen in een 3D fysiologisch of fysiologisch-achtige omgeving meten.
Intravitaal imaging / microscopie is de gouden standaard voor het meten van celmigratie in een 3D fysiologische context. Dit geldt niet alleen tot extracellulaire matrix-cel interacties, maar ook om de interacties tussen verschillende celtypen zoals tumorcellen en endotheelcellen tijdens extravasatie 16 of lymfocyttransport binnen de lymfeklier 17, die tot op heden mogelijk, als gevolg verbeterde fluorescentie microscopie, zoals 2-photonconfocale laser scanning microscopie, het gebruik van vitale fluorescente kleurstoffen en transgene muizenstammen expressie fluorescerende eiwitten derivaten 12,16,17. Daarnaast kan intravitale beeldvorming / microscopie worden gecombineerd met handmatige en geautomatiseerde cel bijhouden 18. Vanwege de noodzaak van een 2-foton confocale laser scanning microscopie en dieren (en geschikte transgene diermodellen) intravitale beeldvorming / microscopie is een nogal dure techniek.
Om de beperkingen van de Boyden kamer / transwell test en de scratch test / wondgenezing assay overwinnen en de migratie van verschillende celtypen te analyseren in een 3D-omgeving 3D collageenmatrix migratie assay ontwikkeld 11,19. Daarbij migreren cellen ingebed in een 3D collageenvezelnetwerk, die meer lijkt op de in vivo situatie. Gezamenlijk, als gevolg van time-lapse video microscopie echte cel migratie wordt gemeten zodat de VASTSTELLInatie van verschillende migratieparameters en hun veranderingen in reactie op pro-trekkende factoren of remmers. Verschillende celtypes kunnen worden geanalyseerd met deze techniek, zoals lymfocyten en leukocyten 11,20, hematopoëtische stam / progenitorcellen 21-24 en tumorcellen 5,25-29. Naast enkele cellen ook clusters cel of sferoïden kunnen worden ingebed in de collageen matrix samenvalt met de analyse van de emigratie van afzonderlijke cellen van de cel cluster / sferoïde in het collageen rooster 30,31.
Dit protocol geeft een overzicht van een eenvoudige maar krachtige techniek het migrerende gedrag van verschillende celtypes in een 3D-omgeving te analyseren – een in vitro methode die in de resultaten die dicht bij de in vivo situatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermogen om te migreren is een kenmerk van tumorcellen 4. Zonder de mogelijkheid om los te maken van de primaire tumor en migreren door het omringende bindweefsel tumorcellen kunnen geen secundaire laesies, die de belangrijkste doodsoorzaak van bijna alle kankerpatiënten zaad. Vanwege deze relatie veel studies zijn gericht op kankercellen migratie. Het doel van deze studie is de identificatie van nieuwe doelmoleculen en doel wegen die efficiënt blokkeren migratie van tumorcellen, waardoor afbreuk of afr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica DM IL inverted microscope | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| Microscope stage heater | Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany | ||
| JVC C1431 video camera | JVC, Bad Vilbel, Germany | ||
| Axis 241Q video server | Axis communication GmbH, Ismaning, Germany | ||
| Mac G5 Computer | Apple Macintosh | ||
| iMac | Apple Macintosh | ||
| FileMaker Pro | FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Multi-camera video surveillance software(Security Spy) | Bensoftware, London, UK | ||
| Runtime Revolution Media 2.9.0 | RunRev Ltd., Edinburgh, UK | ||
| Paraffin | Applichem GmbH, Darmstadt, Germany | A4264 | |
| Petrolatum jelly | local drug store | ||
| Purecol (liquid collagen) | Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands | contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV) | |
| 10x MEM | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M0275 | |
| 7.5% Sodium Bicarbonate solution | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | S8761 | |
| EGF | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | E9644 | |
| U73122 | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | 662035 | dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use |
Referencias
- Dittmar, T., Zänker, K. S. . Cell Fusion in Health and Disease. 1, (2011).
- Dittmar, T., Zänker, K. S. . Cell Fusion in Health and Disease. 2, (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
- Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
- Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
- Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
- Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
- Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
- Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
- Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
- Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711 (2013).
- Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
- Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
- Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
- Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
- Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
- Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
- Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
- Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
- Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
- Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
- Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
- Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
- Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
- Alberts, B., et al. . The extracellular matrix of animals. , (2002).
- Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
- Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
- Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
- Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
- Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).
