Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo
Summary
El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.
Abstract
Hay una necesidad urgente de desarrollar enfoques para reparar el corazón dañado, el descubrimiento de nuevas drogas terapéuticas que no tienen efectos tóxicos sobre el corazón, y la mejora de las estrategias para modelar con precisión la enfermedad cardíaca. El potencial de la explotación de la tecnología humana inducida de células madre pluripotentes (hiPSC) para generar músculo cardiaco "en un plato" para estas aplicaciones sigue generando gran entusiasmo. En los últimos años, la capacidad de generar de manera eficiente las células cardiomiogénico partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) ha mejorado en gran medida, nos ofrece nuevas oportunidades para modelar etapas muy tempranas del desarrollo del corazón humano y no tengan acceso. En contraste con muchos métodos anteriores, el protocolo de diferenciación de cardiomiocitos describe aquí no requiere la agregación de células o la adición de activina A o BMP4 y robusta genera cultivos de células que son altamente positivos para la troponina cardíaca I y T (TNNI3, TNNT2), iroquois- proteína clase homeodominioIRX-4 (Irx4), reguladora de la miosina de cadena ligera 2, isoforma muscular ventricular / cardiaca (MLC2v) y miosina reguladora cadena ligera 2, isoforma auricular (MLC2a) por día 10 a través de todas las células madre embrionarias humanas (CMEH) y líneas hiPSC probado para fecha. Las células pueden ser pasados y mantenidos por más de 90 días de cultivo. La estrategia es técnicamente simple de implementar y rentable. Caracterización de los cardiomiocitos derivados de células pluripotentes a menudo incluye el análisis de marcadores de referencia, tanto a nivel de ARNm y proteína. Para el análisis de proteínas, citometría de flujo es una poderosa herramienta analítica para evaluar la calidad de las células en cultivo y la determinación de la homogeneidad subpoblación. Sin embargo, la variación técnica en la preparación de muestras puede afectar significativamente la calidad de citometría de flujo de datos. Por lo tanto, la estandarización de los protocolos de tinción debería facilitar las comparaciones entre diversas estrategias de diferenciación. En consecuencia, optimizado los protocolos de tinción para el análisis de Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, y TNNT2 por citometría de flujo se describen.
Introduction
La generación de cardiomiocitos de hPSCs, incluyendo células madre y hiPSC, puede funcionar como un modelo in vitro de los procesos de desarrollo cardíacas humanas muy tempranas, proporcionando información sobre las etapas de otra manera no accesibles para los estudios mecanicistas. Este sistema modelo ofrece oportunidades únicas para estudiar los mecanismos moleculares que controlan el compromiso de linaje cardiaco y la especificación del destino celular. En los últimos años, la capacidad de generar eficazmente células cardiomiogénico de hPSCs ha mejorado en gran medida 1-15. Sin embargo, entre los protocolos hay una variación línea celular con respecto a la eficiencia en la generación de células cardiomiogénico y temporización en la que las células expresan marcadores específicos para cada cámara (por ejemplo, ventrículo y aurículas). Idealmente, para futuras aplicaciones de este sistema de modelo, se desean más poblaciones homogéneas de células funcionalmente definidos. En contraste con los métodos anteriores, el protocolo de diferenciación de cardiomiocitos describe aquí no requiere ceagregación ll o la adición de proteínas activina A o morfogenética ósea 4 (BMP4) y robustamente genera culturas altamente positivo para TNNI3 TNNT2, Irx4, MLC2v y MLC2a por día 10 células en todas las líneas de células madre y hiPSC probados hasta la fecha. La estrategia es técnicamente fácil de implementar, especialmente en comparación con cultivos tridimensionales, la cultura de masas, o estrategias basadas cuerpo embrioide 4-9, y se definió recientemente en un estudio que describe una molécula pequeña con toxicidad selectiva a hPSCs (Boheler et al. ) 65. Las características de este protocolo incluyen la diferenciación de hPSCs en cultivo en monocapa utilizando una sola capa de una matriz calificado hESC (Matrigel), medios completamente definidos que utilizan pequeñas moléculas que modulan la señalización Wnt (similar, pero distinta de 1,2,7,13), y flujo optimizado citometría de métodos de tinción para la evaluación de la eficiencia de la diferenciación y la identidad de la célula. En resumen, las ventajas de este protocolo en comparación con los informes anteriores incluyen su costo-efectividad, reproducibilidad y su alta eficiencia para la generación de cardiomiocitos entre múltiples líneas de HPSC, incluyendo células madre y hiPSC líneas.
La citometría de flujo es una poderosa herramienta de análisis para evaluar la calidad de las células en cultivo y determinar la homogeneidad subpoblación, y con un diseño experimental adecuado, pueden proporcionar mediciones cuantitativas. Al igual que con todas las estrategias basadas en anticuerpos, la interpretación precisa de los resultados experimentales requiere que los elementos del diseño del ensayo, incluyendo la concentración de anticuerpo y la fijación y las condiciones de permeabilización (cuando dirigidas a antígenos intracelulares) son cuidadosamente probados para cada anticuerpo como condiciones sub-óptimas afectan significativamente la eficiencia del anticuerpo vinculante, y por lo tanto, la interpretación de los resultados. Es importante destacar que, si se requiere la cuantificación, los anticuerpos monoclonales son esenciales, como los anticuerpos policlonales pueden reconocer epítopos múltiples y son propensas a la variación de lote a lote. Actualmente, una variedad de anticuerpos (polyclonal protocolos y monoclonales) y tinción se han descrito para la evaluación de la diferenciación in vitro, por lo que es difícil comparar la eficiencia de cardiomyogenesis entre protocolos 1,2,9,11. Por esa razón, los anticuerpos monoclonales se utilizan cuando esté disponible para todos los análisis de citometría de flujo. De cara al futuro, se espera que la normalización de estos protocolos de tinción, especialmente con respecto a la cuantificación, deben permitir una mejor comparación entre las estrategias de diferenciación.
La elección de los marcadores, y sus correspondientes anticuerpos, que se utiliza para evaluar la pureza de in vitro cardiomyogenesis varía entre los informes. TNNT2 se ha considerado un indicador de las células comprometidas con el destino cardiomiogénico y se utiliza habitualmente para evaluar la eficacia de los protocolos de diferenciación cardíacas. Sin embargo, TNNT2 también se expresa en el músculo esquelético durante el pollo y rata desarrollo temprano 16,17 y está presente en el músculo liso humano 18 </sup>. Por lo tanto, TNNT2 no es necesariamente un marcador específico de cardiomyogenesis humana in vitro. MLC2v y MLC2a se utilizan habitualmente como marcadores indirectos de subtipos ventriculares y auriculares, respectivamente. Sin embargo, los retos con confiar en MLC2v y MLC2a para determinar el subtipo de cardiomiocitos en el contexto de la diferenciación in vitro surgen del hecho de que estos productos génicos no se puede restringir a una cámara específica largo del desarrollo cardíaco, del tubo de corazón a través de adulto. En el roedor bucle corazón, MLC2a ARNm es predominante en la / zona de tracto de entrada auricular y MLC2v ARNm es predominante en las regiones del tracto ventricular / flujo de salida. En el corazón de bucle, co-expresión de MLC2a y MLC2v ARNm se observó en el tracto de entrada, canal atrioventricular y el tracto de salida 19,20. A los 3 días después del nacimiento, MLC2v ARNm está restringida al ventrículo y por 10 días después del nacimiento, MLC2a se limita a las aurículas en el corazón de rata neonatal 19. Por lo tanto, la interpretaciónde los datos relativos a la eficiencia y la identidad de subtipo cardiomyogenesis no sólo deben considerar la presencia y cantidad de los niveles de marcadores de referencia, pero deben tener en cuenta la etapa de desarrollo (s) a la que los puntos de tiempo de la diferenciación que se analizan corresponden. Esto es especialmente importante teniendo en cuenta que la etapa de maduración de las células cardiomiogénico generados por diferenciación in vitro de hPSCs se asemeja más estrechamente a los del desarrollo fetal / embrionario 21-25. Por lo tanto, basándose en la expresión espacial de un marcador en el corazón postnatal puede no ser apropiado para la evaluación de células derivadas de HPSC, al menos en algunos casos.
En un esfuerzo por facilitar el desarrollo de criterios más específicos para la definición de la identidad de los cardiomiocitos in vitro, TNNI3 se considera que es un marcador útil para evaluar cardiomyogenesis in vitro, ya que se limita al músculo cardiaco a lo largo de la embriogénesis en el pollo y pez cebra 15,20y está ausente en el músculo esquelético fetal humano 26. Mientras TNNI1 está presente en el corazón fetal humano, TNNI3 es la única isoforma TNNI presente en el corazón adulto normal 27,28. En cuanto a la identidad subtipo de cardiomiocitos, Irx4 29-31 es un marcador informativo de las células con un destino ventricular. En el nivel de proteína, Irx4 ha demostrado recientemente ser restringido al ventrículo del corazón del tubo lineal a través de etapas neonatales en el ratón 32. En consecuencia, se describen los protocolos de tinción optimizados para el análisis de TNNI3 y Irx4 por citometría de flujo. Para nuestro conocimiento, esta es la primera descripción de un método para la tinción basada en anticuerpos eficiente y análisis de los niveles Irx4 en cardiomiocitos humanos por citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Crítico para el éxito del protocolo de diferenciación es el uso de cultivos de alta calidad de hPSCs que han sido sometidas a pases en el nivel de células individuales durante al menos cinco pasajes antes del inicio de la diferenciación. Eficiencias de diferenciación similares se observan rutinariamente entre varias líneas de HPSC si son 100% confluentes en el inicio de la diferenciación, independiente de la línea celular. Se observa la eficiencia subóptima si la confluencia de las células en el inicio de la …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el NIH 4R00HL094708-03, Asuntos de Investigación MCW Comité Nuevo Premio Facultad, y la fundación de Kern (fondos de inicio) en el Colegio Médico de Wisconsin (RLG); Investigación del Consejo de Becas basada tema de Hong Kong Esquema Investigación T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM Dr2a-05394, y AHA Establecido Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoral Fellowship 12POST12050254 (PLP). Damos las gracias a Esperanza Campbell en la Citometría de Flujo del Instituto de Investigación de la Sangre de Wisconsin para obtener ayuda con la recopilación de datos y de una cuidadosa revisión del manuscrito.
Materials
| Name of Reagent / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow cytometry reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10X) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6 well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 mL syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
Referencias
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