Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van "Cargo Mapping" Analyse
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
Inzicht in de mechanismen waarmee moleculaire motoren hun activiteiten coördineren om vesiculaire ladingen binnen neuronen vervoeren vereist de kwantitatieve analyse van motor / vracht verenigingen bij de enkele blaasje niveau. Het doel van dit protocol kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebruiken correlatie ("kaart") de positie en richting van de beweging van levende lading van de samenstelling en relatieve hoeveelheden van motoren verbonden met dezelfde lading. "Cargo mapping" bestaat uit levend beeldvorming van fluorescent gelabelde ladingen bewegen axons gekweekt op microfluïdische inrichtingen, gevolgd door chemische fixatie tijdens de opname van levende beweging en daaropvolgende immunofluorescentie (IF) kleuring van exact dezelfde axonale gebieden met antilichamen tegen motoren. Colokalisatie tussen ladingen en hun bijbehorende motoren wordt beoordeeld door het toewijzen van sub-pixel positie coördinaten naar motor en vracht kanalen, door het aanbrengen van Gaussische functies om de diffractie-limited puntspreidingsfuncties vertegenwoordigen individuele fluorescerende puntbronnen. Vaste lading en motorische beelden worden vervolgens gelegd op percelen van vracht-verkeer, tot "kaart" om hun bijgehouden trajecten. De sterkte van dit protocol is de combinatie van levende en IF gegevens aan voor het transport van vesiculaire ladingen in levende cellen opgetekend en motoren gekoppeld aan deze exact dezelfde vesicles te bepalen. Deze techniek overwint eerdere uitdagingen die biochemische methoden gebruiken om de gemiddelde motor samenstelling van gezuiverd heterogene bulk blaasje populatie te bepalen, omdat deze methoden niet composities op enkele bewegende lading onthullen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor de analyse van andere transport- en / of handel trajecten in andere celtypes om de beweging van afzonderlijke intracellulaire structuren correleren met hun eiwitsamenstelling. Beperkingen van dit protocol zijn de relatief lage omzet hebben vanwege de lage efficiëntie van de transfectie van gekweekteprimaire neuronen en een beperkt gezichtsveld beschikbaar voor hoge-resolutie imaging. Toekomstige toepassingen kan werkwijzen omvatten het aantal neuronen tot expressie fluorescent gelabelde lading verhogen.
Introduction
Intracellulair transport is essentieel in alle celtypes voor de afgifte van eiwitten, membranen, organellen, en signaalmoleculen verschillende cellulaire domeinen 1. Neuronen zijn zeer gespecialiseerd cellen met lange, gepolariseerde projecties die belangrijke mate afhangen van intracellulaire transport van essentiële goederen voor hun lange afstand levering aan diverse axonale microdomeinen. Dit transport wordt gemedieerd door kinesins en dyneins – twee grote families van de moleculaire motor eiwitten – die binden aan ladingen en spoor langs gepolariseerd microtubuli in anterograde en retrograde richtingen, respectievelijk. Terwijl retrograde beweging wordt voornamelijk gemedieerd door dynein, wordt beweging in de anterograde richting vergemakkelijkt door een groot, functioneel diverse familie van kinesine motors. Bijgevolg kunnen anterograde transport van axonale ladingen worden gemedieerd door verschillende familieleden van de kinesine superfamilie 1-5. Hoewel sommige ladingen bewegen voortdurend in beide richtingen, most ladingen bewegen bidirectioneel en reverse vaak op hun weg naar hun eindbestemming 1,5-13. Verder is aangetoond dat de motoren van de tegengestelde gerichtheid associate gelijktijdig tot lading, het verhogen van de vraag hoe gereglementeerde beweging van ladingen wordt gecoördineerd door tegenovergestelde polariteit motoren 5-7. Samen axonale transport van lading is een gecoördineerde proces dat wordt gereguleerd door de samenstelling van motoren en hun specifieke biochemische activiteiten, die op hun beurt afhankelijk van diverse adapters en regelgevende bindingspartners 14.
Trouw beschrijven mechanisme van axonaal transport voor een bepaalde lading en de onderliggende regulering van dat transport ontdekken, is het noodzakelijk dat de samenstelling van motorische eiwitten en hun regulatorische bindingspartners geassocieerd met individuele goederen tijdens het vervoer van levende bepalen. Andere methoden, zoals biochemische benaderingen schattingen over gemiddelde motof samenstellingen op gezuiverd heterogene blaasje populatie, maar deze schattingen niet het type of de bedragen van de motoren gekoppeld aan enkele bewegende blaasjes onthullen. Ook reconstitutie van vesicle transport langs voorgemonteerde microtubules in vitro geactiveerd meten van de hoeveelheid van een type motor op een vesicle level 15. Echter, deze experimenten niet direct correleren het aantal motoren van de transporteigenschappen van deze vesicles en transport gemeten in afwezigheid van cellulaire regulerende factoren.
Een protocol wordt hier gepresenteerd, waarvan de motor samenstelling (type en de relatieve hoeveelheid van de motoren) van de afzonderlijke bewegende blaasjes uit immunofluorescentie (IF): gegevens die endogeen tot expressie motor eiwitten bepaalt, en correleert deze parameters om het vervoer van levende exact dezelfde blaasjes in neuronen 16. Deze methode is gebaseerd op een nauwkeurige kartering van IF-to-live-beweging vracht gegevens. Dit wordt bereikt door growing hippocampus muis neuronen in microfluïdische systemen, volgens vastgestelde protocollen 17-19. Deze apparaten zorgen voor de identificatie en correlatie ("mapping") van axonen en enkele bewegende lading in vaste en live lichtmicroscopie modaliteiten (Figuur 1). Gekweekte neuronen worden getransfecteerd met fluorescent gelabelde lading eiwitten waarvan het transport wordt afgebeeld op een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te gedetailleerde informatie beweging die is uitgezet in kymographs verkrijgen. Tijdens beeldvorming wordt neuronen gefixeerd met paraformaldehyde, en vervolgens gekleurd met antilichamen tegen endogene eiwitten motor. Vaste lading en motorische beelden worden gelegd op live-beweging kymographs naar "kaart" (colocaliseren) hen naar de live-beweging vracht trajecten 16. Om de live-beweging van ladingen met de vereniging van motorische eiwitten correleren, is colocalization geanalyseerd met behulp van een op maat gemaakte MATLAB software pakket genaamd "Motor colokalisatie "16,20. Fluorescent gelabelde ladingen en motoren genereren buigingsbegrensd punctate functies die gedeeltelijk kunnen overlappen. Om de positie van overlappende puncta lossen, eerst de software past automatisch Gaussische functies aan elke puntspreidingsfunctie, wat neerkomt op individuele fluorescerende puncta, om hun precieze XY sub-pixel-positie te bepalen coördineert en intensiteit amplitudes 21-23. De posities van motoren en ladingen zijn vervolgens vergeleken met elkaar colocalization 16,20 bepalen. Daarom is deze werkwijze nader kent colocalization tussen fluorescente puncta vergelijking met andere methoden 24.
De kracht van deze methode is het vermogen om de colocalization motoren met individuele lading beoordelen gefixeerde cellen, waarvoor levende beweging trajecten (bijvoorbeeld de richting waarin zij bewegen bij de fixatie) zijn rec geweestorded. Met deze methode werden kinesins en dyneins vond gelijktijdig koppelen aan blaasjes die het normale prioneiwit dragen (PrP C -cellular), een neuronaal verrijkt lading die in twee richtingen beweegt of stilstaat in axonen 16. Deze analyse liet de formulering van een werkmodel voor de regulering van PrP C blaasje beweging waarin anterograde (kinesine) en retrograde (dynein) motoren hun activiteiten coördineren om de blaasjes te verplaatsen in beide richtingen of stationair te blijven, terwijl in verband met de lading . Een ander sterk punt van deze methode is het potentieel brede toepasbaarheid voor het karakteriseren van colocalization / vereniging van vele fluorescent gelabelde ladingen die in bewegen vrijwel elk type cel, met een andere proteïne (s) van belang. Zo zou levende / vaste correlatie mogelijk maakt detectie van voorbijgaande proteïne-lading interacties kan zoveel afzonderlijke fluorescent gelabelde bewegende deeltjes worden geanalyseerd over een gewenst period van tijd. Gezien de brede toepasbaarheid en de aard van de vragen die deze methode kan pakken, zal dit protocol van belang zijn voor een breed publiek van cel biologen waaronder die studeert handel en transport in neuronen of in andere celtypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde protocol kan de correlatie van gerichtheid verkeer van individuele fluorescerende microtubule gebaseerde bewegende lading deeltjes met het type en de relatieve hoeveelheid geassocieerde motor eiwitten in levende neuronen. Eerder, de totale motor samenstelling van axonale vesiculaire lading werd getest op heterogene populaties van biochemisch gezuiverd blaasjes en organellen 9,15. Echter kenmerkend motor samenstelling voor één soort lading in cellen uitdagend…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
Referencias
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).
