Un método para cuantificar el tamaño orofacial y la forma de los embriones de Xenopus laevis ha sido desarrollado. En este protocolo, las mediciones de tamaño tradicionales se combinan con morfometría geométrica para permitir análisis más sofisticados de desarrollo y defectos orofacial.
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Artículo de método
La cuantificación de fenotipos en Orofacial Xenopus
En este artículo
Resumen
Resumen
Xenopus se ha convertido en una herramienta importante para la disección de los mecanismos que rigen el desarrollo y defectos craneofaciales. Un método para cuantificar el desarrollo orofacial permitirá análisis más riguroso de fenotipos orofaciales en derogación con sustancias que genéticamente o molecularmente pueden manipular la expresión génica o la función de proteínas. El uso de dos imágenes dimensionales de las cabezas de embriones, se miden las dimensiones tradicionales de tamaño-tales como orofacial anchura, altura y zona-. Además, una medida de la redondez de la abertura de la boca embrionario se utiliza para describir la forma de la boca. Morfometría geométrica de estas dos imágenes dimensionales también se realiza para proporcionar una visión más sofisticada de los cambios en la forma de la región orofacial. Puntos de referencia se asignan a puntos específicos en la región orofacial y coordenadas se crean. Un análisis de componentes principio se utiliza para reducir coordenadas señal a los componentes principales que discriminan entonces el tratamientogrupos. Estos resultados se muestran como un gráfico de dispersión en el que los individuos con formas orofaciales similares se agrupan. También es útil para llevar a cabo un análisis de función discriminante, que compara estadísticamente las posiciones de los puntos de referencia entre dos grupos de tratamiento. Este análisis se muestra en una rejilla de transformación donde los cambios en la posición de punto de interés se consideran como vectores. Una rejilla se superpone a estos vectores a fin de que se muestra un patrón de deformación para mostrar dónde posiciones hitos significativos han cambiado. Cambios en la forma en el análisis de la función discriminante se basan en una medida estadística, y por lo tanto pueden ser evaluados por un valor de p. Este análisis es sencillo y accesible, que sólo requiere un estereoscopio y software freeware, y por lo tanto será una investigación y la enseñanza valiosa de recursos.
Introducción
Entre los tipos más frecuentes y devastadores de defectos de nacimiento en humanos son los que afectan a la boca y la cara, como hendiduras orofaciales 1. Los niños con estructuras orofaciales malformados se someten a múltiples cirugías durante toda su vida y luchan con desfiguraciones faciales, el habla, la audición y problemas de alimentación. Por lo tanto, lo que facilita una nueva investigación en el desarrollo de craneo y orofacial es de suma importancia para la prevención y el tratamiento de estos tipos de defectos de nacimiento en seres humanos. Xenopus laevis ha surgido como una nueva herramienta para la disección de los mecanismos que rig....
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Protocolo
Todos los experimentos realizados utilizando Xenopus laevis han sido aprobados por IACUC (protocolo # AD20261).
1. Reactivos Preparación y materiales necesarios
- Reactivos:
- Hacer 1 L de 10x MBS (Modificado salinos de Barth) solución 22. Añadir NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8) y NaHCO3 (25 mM) a 1 L de agua destilada. Ajustar el pH a 7,8 con NaOH.
- Hacer 1 L de 1x MBS por dilución de 100 ml de 10x solución de MBS en 900 ml de agua destilada. Añadir 0,7 ml de solución M CaCl 2 1.
- Hacer 1 L de 0,1X MBS por dilución de 10....
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Resultados
Aquí, se demostró un análisis cuantitativo de tamaño y forma orofacial para comparar los embriones tratados con un inhibidor de receptor de ácido retinoico (RAR inhibidor) a los controles no tratados. Los embriones se trataron con una concentración 1 M de este inhibidor químico de la etapa 24 a 30 (26-35 HPF), eliminado, y se fijaron en la etapa 42 (82 HPF). Luego fueron procesados y analizados como se describe en el protocolo. Los resultados son los datos originales, pero consistente con las observaciones en las publ.......
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Discusión
Xenopus laevis se ha convertido en una herramienta útil para la disección de los mecanismos de desarrollo de desarrollo orofacial subyacente; sin embargo, actualmente no existen protocolos que describen los cambios de tamaño y forma de esta región en las ranas. El método aquí descrito contribuirá significativamente a la esfera del desarrollo orofacial al permitir una cuantificación más rigurosa de fenotipos orofaciales en Xenopus y otros vertebrados.
El primer aspecto, más .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Fondos para la instalación de A. Dickinson de VCU apoyaron este trabajo.
Los autores desean agradecer a Dan Nacu por su talento artístico en la creación de la ilustración esquemática.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio de disección | Zeiss | equipado con cámara AxioCamICC1 | |
| Pinza Dumont #5 Inox | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Bisturí estéril y desechable | Sklar | 06-2015 | |
| Placa de 24 pocillos | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Pipetas de transferencia desechables | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Placas de Petri de 150 mm x 15 mm | Incubadoras de 351058 | ||
| Ectotherm | ajustadas a 15 & grados; C o 20 ° C | ||
| Arcilla para modelar | Premo, u otra arcilla | en blanco o negro | |
| Aguja de burla recta | Thermo Scientific | 19010 | |
| Tubo capilar (para agujas) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1,0 mm de diámetro exterior x 0,5 mm de diámetro interior/fibra, 100 mm cada |
| Extractor de agujas, modelo P-97 | Sutter Instrument Co. | Extractor de agujas: P-97 Tirador de micropipetas Flaming/ Bown Filamento: FB300B | Para los filamentos, utilice filamentos de caja cuadrada Sutter de 3,00 mm, 3,0 mm de ancho. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cisteína | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Polvo de paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| placas de Petri | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm de diámetro y 150 mm de diámetro |
| 100% etanol | VWR | 89125-170 |
Referencias
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012). <....
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Reimpresiones y permisos
