Les nématodes entomopathogènes sont des vers ronds terricoles qui parasitent une grande variété d'insectes. Nous démontrons méthodes d'échantillonnage utilisées pour l'isolement de ces nématodes dans le sol au moyen de deux techniques: l'appâtage des insectes et le piège blanc modifié, pour la récupération des nématodes à partir d'échantillons de sol et de cadavres d'insectes infectés, respectivement.
Les nématodes entomopathogènes (aka EPN) représentent un groupe de nématodes terricoles qui parasitent une grande variété d'insectes. Ces nématodes appartiennent à deux familles: Steinernematidae et Heterorhabditidae. Jusqu'à présent, plus de 70 espèces ont été décrites dans le Steinernematidae et il ya environ 20 espèces dans le Heterorhabditidae. Les nématodes ont un partenariat mutualiste avec des bactéries Enterobacteriaceae et ensemble, ils agissent comme un puissant complexe insecticide qui tue un grand nombre d'espèces d'insectes.
Ici, nous nous concentrons sur les techniques les plus courantes en considération pour la collecte de l'EPN du sol. La deuxième partie de cette présentation se concentre sur la technique de l'insecte-appâts, une approche largement utilisée pour l'isolement de l'EPN à partir d'échantillons de sol, et la technique de piège Blanc modifié qui est utilisé pour la récupération de ces nématodes des insectes infectés. Ces méthodes et ces techniques sont les principales étapes pour la mise en place réussie de l'EPN culteres dans le laboratoire et également former la base pour d'autres essais biologiques qui considèrent que ces nématodes comme organismes modèles pour la recherche dans d'autres disciplines biologiques. Les techniques présentées dans cette présentation correspondent à ceux exécutés et / ou conçu par les membres du SP Stock laboratoire ainsi que ceux décrits par différents auteurs.
Beaucoup de nématodes sont associés avec des insectes, et leurs interactions hôte vont de bénéfique à préjudiciable. Ici, nous nous concentrons sur un groupe de nématodes qui sont des agents pathogènes d'insectes, aussi connu comme nématodes entomopathogènes (ou EPN). Deux familles de nématodes appartiennent à ce groupe de nematodes: Steinernematidae et Heterorhabditidae 11,13. Leur effet pathogène est en effet conféré par leur interaction avec les bactéries entériques facultatives anaérobies (bactéries Xenorhabdus associent steinernematids et bactéries Photorhabdus associer à heterorhabditids) 2. Les bactéries sont vectorisés d'un insecte hôte à un autre par la seule étape sans nématodes vivant, le mineur infectieux de la troisième étape (également connu sous le nom dauer juvénile, juvénile infectieux ou IJ), qui vit dans le sol. Une fois à l'intérieur de l'insecte, les nématodes libèrent les bactéries dans l'hémolymphe de l'insecte, qui tuent l'hôte de l'insecte par septicémie massif. Les bactéries aussidégrader les tissus de l'insecte et deviennent la source de nourriture des nématodes, ce qui leur permet de mûrir et de se multiplier. Habituellement, une ou deux générations de nématodes adultes sont produits dans le cadavre d'insecte. La descendance des dernières réassocie génération adulte avec quelques cellules bactériennes dans un plus spécialiser de manière que leur relation nutritionnel précédente, et de nourrir ces cellules dans leurs intestins comme ils se déplacent hors de la carcasse de l'insecte dans le sol où ils attendront un autre insecte à parasiter 6,11,14 (Figure 1).
Depuis leur découverte en 1927, l'EPN ont été considérés comme des alternatives valables aux pesticides chimiques, car ils peuvent parasiter un large éventail d'insectes qui sont nuisibles agricoles 3,4,5. Cependant, au cours des deux dernières décennies, ces nématodes et leurs bactéries symbiotiques ont été reconnus comme un système modèle pour l'étude malléable aspects biologiques, écologiques et évolutifs de l'hôte microbe INTERACTIONns 14.
Le but de cette présentation est de montrer les méthodes et les techniques les plus couramment utilisées pour l'échantillonnage et l'isolement de l'EPN sol. Une variété d'outils est disponible et peut être utilisé pour prélever des échantillons de sol, y compris: carottiers du sol, truelles, pelles post-trous, tarières, des tubes d'échantillonnage, pelles à la main, entre autres (figure 2).
Selon le but de l'étude, deux stratégies d'échantillonnage peuvent être envisagées: a) stratifié, b) un échantillonnage aléatoire (Figure 3). L'échantillonnage stratifié est habituellement utilisé dans le cadre d'une étude intensive dans une zone déterminée ou démarquée sur une période de temps donnée. En général, un transect est démarquée et des échantillons de sol sont prélevés à des intervalles prévus dans le transect sur une période de temps (figure 3A) 15. L'échantillonnage aléatoire est généralement utilisé lorsqu'on se concentre sur une vaste zone. Cette stratégie d'échantillonnage a été utilisée pour étudier la diversité des EPN felon une grande surface ou d'une région géographique (figure 3B) 12. Un certain nombre de facteurs peut être considéré en fonction de l'objet de l'étude, y compris un large éventail de hauteurs, textures de sol et des habitats (p. ex., Les champs cultivés, les forêts, les pâturages, parcs, bords de mer, les zones riveraines, etc.)
Nous montrons la technique de l'insecte-appâts, qui a été initialement décrit par Literie et Akhurst 1 et représente une alternative simple et sélective pour la récupération de l'EPN à partir d'échantillons de sol. Il s'agit d'une procédure sélective qui est basée sur la prémisse que les nématodes (stade IJ) seront attirés par un insecte hôte et parasitent il. Cette technique peut également être envisagée pour l'isolement d'autres agents pathogènes tels que les insectes, les champignons et les bactéries 8,10.
Nous démontrons également la technique de piège blanc modifié qui est utilisé pour récupérer la descendance des nématodes chez des hôtes d'insecte infectées 7,14. Il s'agit d'un effort rencontréhod qui offre l'avantage de récupérer un «propre» nématode progéniture libre de débris des cadavres d'insectes dégradantes.
Enfin, les techniques décrites et présentées dans cet article correspondent à ceux conçus et / ou réalisés dans notre laboratoire ainsi que ceux décrits par divers collègues et collaborateurs.
Cette démonstration est le premier des deux présentations qui décrivent un certain nombre de techniques qui sont couramment utilisés pour l'étude de l'EPN et de leurs bactéries symbiotiques. Ces techniques constituent des étapes clés de la mise en place réussie des cultures de l'EPN dans le laboratoire et constituent également la base pour d'autres essais biologiques qui emploient EPN comme organismes modèles pour la recherche.
Diverses études de sol de l'EPN …
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier les anciens membres de la Banque laboratoire: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta et Victoria Miranda-Thompson pour leurs contributions à l'amélioration de plusieurs de ces protocoles. Nous reconnaissons l'appui National Science Foundation (subventions IOS-0840932 et 0724978 IOS) à SP Stock.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | for insect baiting technique |
Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | infection chamber and White trap assembly |
60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | infection chamber and White trap assembly |
100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | infection chamber and White trap assembly |
ZIPloc Plastic Bags | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
Mechanical Pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | infection chamber and White trap assembly |
pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | infection chamber and White trap assembly |
Bleach | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
Sodium Hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | soil sampling , desisnfecting |
Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
Tubular soil sampler | Accuproducts | N/A | soil sampling |
Soil Probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | soil sampling |
Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |