Physiologiques Recordings et ARN séquençage des annexes gustatives du Mosquito fièvre jaune<em> Aedes aegypti</em

Summary

L'utilisation de deux méthodes pour estimer l'expression des gènes dans les grands appendices gustatives de Aedes aegypti, nous avons identifié l'ensemble des gènes sous-jacents supposément les réponses neuronales à des composés amers et de répulsion, comme déterminé par l'examen électrophysiologique.

Abstract

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Introduction

Il a été démontré composés comme DEET, Picaridin, Citronellal et IR3535 pour repousser efficacement les moustiques, y compris les vecteurs de maladies importantes Aedes aegypti ^1,2. Nous enregistrons des potentiels d'action des neurones sensoriels associés à gustative sensilles spécifique pour déterminer les cellules impliquées avec moustiquaire répulsion. Couplé avec le séquençage aval des gènes exprimés dans ces tissus, nous pouvons identifier les gènes les plus susceptibles médiation des réponses de ces cellules afin de dépister de nouveaux composés pour l'amélioration des capacités de répulsion.

ARN-Seq est un outil puissant, devient rapidement la norme pour le suivi des changements temporels et spatiaux de l'expression génique. Analyse de l'ARN-seq appendices chimiosensoriels insectes et les organes ont été utilisées pour découvrir des récepteurs moléculaires dans plusieurs espèces d'insectes ^5.3, ce qui améliore grandement le gène par PCR conventionnelle basée recherches par le gène ^6. Les insectes représentent la classe des animaux les plus divers, présentant de nombreuses occasions d'étudier le lien entre les gènes et les phénotypes uniques. la technologie de l'ARN-seq peut être utilisé sur ne importe quel tissu insecte vivant. De même, l'enregistrement électrophysiologique à l'intérieur de cellules sensorielles sensilla uniporous gustative peut être réalisée dans de nombreuses espèces d'insectes. Le couplage de ces deux techniques permet aux chercheurs de réduire l'ensemble des gènes impliqués dans le phénotype observé chimiosensorielle. Différentes espèces présenter des défis spécifiques, mais peuvent informer la connexion entre les gènes des récepteurs chimiosensoriels et une adaptation chimiosensorielle. La taille et la morphologie des chimiosensorielle sensilles est variable et peut exiger énormément de dépannage lors de l'enregistrement des potentiels d'action pour réduire le bruit et d'identifier les signaux reproductibles. Les dissections des organes chimiosensoriels peuvent être trivial ou délicate et longue, en fonction de la morphologie et la taille de l'insecte. Récupération de l'ARN de haute qualité peut exiger un peu de dépannage ainsi, comme éviter certains pigments courscollecte de tissu.

Tout en montrant les effets de composés répulsifs par des essais de comportement est directe et informative, cette approche exige beaucoup de temps et de large par rapport au mécanisme d'action. Électrophysiologie couplé avec l'ARN-seq permet des analyses plus spécifiques de ce qui motive les comportements d'évitement chez les insectes. Une fois que la "boîte à outils" de la discrimination chimique a été identifiée dans une espèce d'insecte, des tentatives plus spécifiques visant à améliorer le répulsifs connus sont possibles. Récepteurs et des protéines associées dans les cellules sensorielles responsables de ces comportements peuvent être exprimées de manière hétérologue pour le dépistage chimique directe. En outre, la modélisation moléculaire peut prédire quels produits chimiques seront obtenir de fortes réponses de ces récepteurs ^7.

L'instantané de tous les gènes actifs dans un ensemble restreint de tissus chimiosensoriels peut également être utile dans l'identification des gènes similaires dans d'autres espèces. Utilisation homologie de séquence et d'expression similarities, les chercheurs peuvent former des ensembles de récepteurs moléculaires les plus susceptibles de médiation réponses aux répulsifs qui sont largement efficaces sur les insectes. Nous présentons le protocole suivant pour aider les chercheurs à déconstruire voies chimiosensoriels insectes et de convaincre plus de se plonger dans l'neuroéthologie de non-modèle et les insectes économiquement importants.

Protocol

1. Elevage Ae. aegypti adultes Les œufs éclosent en environ ¾ pouce d'eau dans le bac peu profond. La surpopulation va réduire la taille des adultes. Larves arrière à 25 ° C (12 hl: 12-HD) et nourrir avec de la nourriture du poisson de fond. NOTE: La suralimentation peut réduire les taux de survie. Retirer pupes individuellement par pipette Pasteur quotidienne et transfert à des plats en plastique (9 cm x 5,5 cm) à l'intérieur de petits seaux de confineme…

Representative Results

Les enregistrements des traces de potentiels d'action Ae. aegypti sensilles gustatives (Figure 1) démontrer l'efficacité de la stimulation directe avec une gamme de produits chimiques. Cette technique peut être utilisée pour quantifier les réponses à tout produit chimique stimulant en comptant les pointes d'une amplitude et la durée donnée sur une plage de temps raisonnable (généralement moins de 500 ms). enregistrements de trace doivent être facilement reproductibles dan…

Discussion

L'aspect le plus difficile de potentiels d'action d'enregistrement de sensilles gustative est de décider lequel des réponses sont «normal». Lorsque l'on utilise seule pointe de sensille gustative l'enregistrement de la première fois pour une espèce d'insectes donnés, le nombre et la sensibilité des neurones récepteurs gustatifs totale (GRNS) sont probablement inconnu. De nombreux enregistrements préliminaires doivent d'abord décider de la gamme et les concentrations de produits chi…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5mL collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a