Este manuscrito describe un protocolo para crecer en redes modulares vitro consistentes espacialmente confinados, los circuitos neuronales interconectadas funcionalmente. Una máscara polimérico se utiliza para patrón de una capa de proteína para promover la adhesión celular sobre el sustrato de cultivo. Neuronas chapados crecen en zonas recubiertas establecimiento de conexiones espontáneas y que muestran actividad electrofisiológica.
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Artículo de método
Diseño, tratamiento de superficies, Celular Forrado, y cultivo de Modular Redes Neuronales Compuesto de circuitos conectados-Inter Funcionalmente
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Resumen
Resumen
El cerebro funciona a través de la activación coordinada y la comunicación dinámica de las asambleas neuronales. Una pregunta abierta importante es cómo un vasto repertorio de motivos dinámicos, que subyacen más diversas funciones cerebrales, puede surgir de una organización fija topológica y modular de los circuitos cerebrales. En comparación con los estudios in vivo de los circuitos neuronales que presentan dificultades experimentales intrínsecas, las preparaciones in vitro ofrecen una posibilidad mucho mayor de manipular y probar las propiedades estructurales, dinámicos y químicas de los sistemas neuronales experimentales. Este trabajo describe una metodología experimental in vitro que permite cada vez mayor de las redes modulares compuestas por asambleas neuronales espacialmente distintas, funcionalmente interconectados. El protocolo permite el control de la (2D) de la arquitectura bidimensional de la red neuronal a diferentes niveles de complejidad topológica.
Un patrón de red deseada puede serlogrado tanto en cubreobjetos regulares y de sustrato incrustado arrays micro electrodos. Estructuras micromecanizadas están en relieve sobre una oblea de silicio y se utilizaron para crear plantillas poliméricos biocompatibles, que incorporan las características negativas de la arquitectura de red deseada. Las plantillas se colocan sobre los sustratos de cultivo durante el procedimiento de revestimiento de la superficie con una capa molecular para promover la adhesión celular. Después de la eliminación de las plantillas, las neuronas se sembraron y se redirigen de forma espontánea a las áreas recubiertas. Al disminuir la distancia inter-compartimiento, es posible obtener los circuitos neuronales ya sea aislados o interconectados. Para promover la supervivencia celular, las células se co-cultivaron con una red neuronal de soporte que está situado en la periferia de la placa de cultivo. Se presentan los registros electrofisiológicos y ópticas de la actividad de las redes modulares obtenidos respectivamente mediante el uso de sustrato incrustado micro matrices de electrodos y de imágenes de calcio. Si bien cada módulo muestra SPONTsincronizaciones globales aneous, la ocurrencia de sincronización entre módulos está regulado por la densidad de la conexión entre los circuitos.
Introducción
Evidencias experimentales y teóricos apoyan la posibilidad de que el cerebro opera a través de la activación coordinada de ensamblajes de pilas de 1-5, que puede considerarse como unidades funcionales dinámicos que interactúan transitoriamente uno con el otro, de conformación y diferentes estados cerebrales subyacentes. Modularidad funcional también es dependiente de y asociado con la organización modular estructural de los circuitos cerebrales 6,7. Cómo función y la estructura de los circuitos cerebrales moldean mutuamente sigue siendo una de las principales cuestiones abiertas en la neurociencia. Para proporcionar una comprensión más profunda ....
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Protocolo
El procedimiento se realizó de acuerdo con las normas del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fue aprobado por el Cuidado y Uso Comité Universidad de Tel Aviv Animal (número de permiso - L-14-019).
1. Elaboración de Instrumentos y PDMS
- Preparar la oblea (Tabla de materiales, u ordenar la oblea de un laboratorio de microfabricación), un bisturí, y un par de pinzas - no es necesaria la esterilización.
- Hacer poli-D-lisina solución (PDL) de acuerdo con las siguientes condiciones: 4 mg / ml en tampón de borato 0,1 M, pH 8, y se almacena a -20 ° C.
- Preparar plantillas de PDMS de....
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Resultados
A SU8-2075 molde sobre una oblea de silicio con un espesor característica de aproximadamente 100 micras se utilizó para dar forma a los PDMS. El patrón se compone de los cuadrados de varias dimensiones, con una longitud de lado y la distancia que varía entre 200 y 700 micras (Figura 1B). El tamaño del cuadrado fue elegido para encajar el campo de visión de un 10X (por islas con una longitud de lado <800 micras) y de un objetivo 20X (por islas con una longitud de lado <400 micras). Tres parámetros,.......
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Discusión
Un protocolo para crecer redes neuronales modulares 2D in vitro compuesto por circuitos funcionalmente interconectados se describe. El procedimiento se basa en modelando una capa de adhesivo celular. Patrones se consigue con PDMS plantillas reproducir la característica negativa de la arquitectura de red deseada. Plantillas de PDMS definen las áreas en las que se deposita la capa adhesiva celular. Una vez que las células se colocan en placas, que espontáneamente se reúnen para las islas recubiertas y auto-organi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el BRIANBOW Proyecto Europeo (el 7PM Jóvenes Exploradores, Los autores desean agradecer a la Dra Jacopo Tessadori por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, y Silvia Chiappalone por su ayuda en la producción de los gráficos utilizados en el video.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Cámara de vacío Nalgene | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lisina PDL | Sigma | P7886 | |
| Grasa de silicona - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Barnizador de hilatura | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| Placa de cultivo de 12 pocillos | Sigma | CLS3336 | |
| 5-fluoro-2'-desoxiuridina | Sigma | F0503 | |
| Uridina | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Sistemas | ||
| TC02 | Sistemas | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1C | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Mínimo Esencial Medio-Eagle | Industrias Biológicas Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrodos Arrays 4Q Multi Channel | Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr manual de | limpieza: http:// www.multichannelsystems.com |
| oblea de silicio | microchem | SU8-2075 Protocolo de | preparación: http://www.microchem.com |
Referencias
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200(2010).
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Reimpresiones y permisos
