Abstract
Proteinsyntes är en grundläggande process för att genuttryck påverkar olika biologiska processer, särskilt anpassning till miljöförhållanden. Den inledande steget, som innebär monteringen av ribosomala subenheter på mRNA-initieringskodonet, involverade inledande faktor inklusive eIF4G1. Defekter i denna hastighetsbegränsande steget av translation är kopplade till olika sjukdomar. För att studera de potentiella konsekvenserna av sådana avregleringar, laevis Xenopus oocyter utgör en attraktiv modell med hög grad av bevarande av viktiga cellulära och molekylära mekanismer med människa. Dessutom, under meiotisk mognad, oocyter transkriptiontryckt och alla nödvändiga proteiner är översatta från redan existerande, maternella mRNA. Denna billig modell möjliggör exogen mRNA för att bli helt integrerad med en effektiv översättning. Här beskrivs ett protokoll för att bedöma översättningen med en faktor av intresse (här eIF4G1) med hjälp Stored moderns mRNA som är de första som polyadenylerat och översatt under oocytmognad som en fysiologisk avläsning. Först mRNA syntetiseras genom transkription in vitro av plasmider av intresse (här eIF4G1) injiceras i oocyter och kinetiken för oocytmognad by Germinal vesikelnedbrytning detektering bestäms. Den studerade moderns mRNA mål är serin / treonin-proteinkinas mos. Dess polyadenylering och dess efterföljande translation utreds tillsammans med uttryck och fosforylering av proteiner av mos signalerings kaskad inblandade i oocytmognad. Variationer av det nuvarande protokollet att lägga fram translationella defekter föreslås också att understryka dess allmänna tillämplighet. Mot bakgrund av nya bevis för att avvikande proteinsyntes kan vara inblandade i patogenesen av neurologiska sjukdomar, ger en sådan modell möjlighet att enkelt bedöma denna försämring och identifiera nya mål.
Introduction
Proteiner är väsentliga delar av cellulära liv och därmed på större skala av organismen. De garanterar en majoritet av cellulära funktioner inklusive struktur, transport, reaktions katalys, reglering, genexpression etc. Deras uttryck är resultatet av en komplex mekanism av translation möjliggör konvertering av ett mRNA till protein. Översättningen kastas olika kontroller för att anpassa sig och för att reglera genuttrycket enligt cell behov, under utveckling och differentiering, åldrande, fysiologiska påkänningar eller patologiska manifestationer.
Översättning är indelat i 3 faser (initiering, töjning och terminering) och presenterar 3 system inledande översättnings för att möta dessa behov: cap beroende, cap oberoende via inre Ribosom Entry Segment (IRES) strukturer och cap-oberoende översättnings Förstärkare ( CITE).
De flesta eukaryota mRNA översätts i en cap-Dependent sätt via 7-metylguanosin 5'-trifosfat lock som fungerar som en funktionen erkännande under proteinsyntes. Detta tak binder till eIF4E, en komponent i eIF4F komplex med eIF4G1 och eIF4A. Associerad med andra partner såsom poly (A) protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA-Met, dessa översättnings initieringsfaktorer tillåter att cirkularisera mRNA och förbättra dess tillgänglighet till former 43S-komplexet tills augusti initieringskodonet erkännande 1. Denna händelse motsvarar utgången av translationsinitieringsstället dvs det första steget av translation.
Cap oberoende översättning används av mRNA som kodar för viktiga proteiner under stressade förhållanden som inducerar till exempel celltillväxt och apoptos. Denna mekanism innebär sekundära strukturer i mRNA 5'- otranslaterade regionen (UTR) kallas IRES, den karboxiterminala änden av eIF4G1 samband med eIF4A och 43S komplexet. Bindningen av denna 43S före inledande complex till IRES initierar locket oberoende översättning utan behov av eIF4E faktor 2,3.
Slutligen, en annan översättning mekanismen fortfarande inte förstått stöder detta lock oberoende översättningsverksamhet under stressade förhållanden via CITE strukturer belägna inom mRNA UTR 4.
Genom dessa olika typer av översättning som skiljer sig med sina invignings steg, spelar översättning en avgörande roll i cellulär homeostas och eventuella förändringar i en av dessa processer skulle alltså påverka organismen med små till stora skaleffekter. Faktum är initieringen ett hastighetsbegränsande steg som reglerar de korrekta processer av mRNA-translation till proteiner och är därför målet för många kontroller och regleringspunkter 5. Vare sig det är för den senare eller komponenter i dessa processer, om man visar sig vara defekt, kommer det störa jämvikten i cellen och därmed kan leda till patologisk Conditioner. I detta sammanhang har mutationer i översättningsfaktorer varit inblandade i flera sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar såsom `leukoencefalopati med försvinnande vit matter' (eIF2B1-5 subenhet) 6, i Walcott-Rallison syndrom (EIF2AK3 gen som kodar för PERK) 7, eventuellt i Parkinsons sjukdom (eIF4G1 p.R1205H) 8. Det är därför viktigt att genomföra cellulära och molekylära studier av dessa mutantproteiner för att öka vår kunskap om sjukdomsutveckling och på den allmänna processen för translationsinitiering.
För att utföra dessa studier, är det viktigt att välja den mest lämpliga modeller för att observera konsekvenserna av dessa mutationer Xenopus laevis oocyter är särskilt väl anpassade till följd av deras fysiologiska och biokemiska egenskaper. Fysiologisk synkronicitet (blockerad i fas G2 av cellcykeln) , hög kapacitet av proteinsyntes (200-400 ng / dag / äggcell), stort antal av extraherat OOCytes från samma djur (800-1000 oocyter / kvinnliga) och cellstorlek (1,2-1,4 mm i diameter) som underlättar deras manipulation. Mikroinjektion av Xenopus oocyter med syntetiserade mRNA kan lätt utföras för att dissekera steg översättnings. I den här vyn det ger andra fördelar. Med tanke på hastigheten på meios progression och översättning efter mRNA mikroinjektion (~ 24 h), representerar Xenopus oocyt ett snabbt system jämfört med ombildade cellulära system (som utvinns från E. coli, vetegroddar eller kaninretikulocyt ...), i vilken en mRNA är översatt med en reducerad översättningshastighet och vid en lägre hastighet. Så, kommer effekterna av en mutation introducerades i en mRNA vara snabbt observerbara och enkelt undersökts i flera oocyter. En annan fördel med Xenopus oocyter är att moderns mRNA är latent och proteinöversättning blockeras innan progesteron stimulering. Tillsats av progesteron är alltså ett bra sätt att styra översättningen induktion. Cytoplasmisk polyadenylation inte inträffar under oogenes. Det börjar under oocytmognad i progesteron-stimulerade ägg i en temporal ordning och fortsätter under tidig utveckling och kan användas för att studera de olika stegen i översättning.
Polyadenyleringen av mos mRNA är bland de första att förekomma och den tillhör med Aurora A / EG2, Histon-liknande B4 mRNA klassen "tidig mognads" gener enligt definitionen i Charlesworth et al. (2004) 9. Den translationella induktion av "sena" mRNA såsom Cyclin A1 och cyklin B1 inträffar vid tiden för embryon vesikler uppdelning (GVBD). Mos mRNA kodar för ett serin / treonin-proteinkinas. Dess översättning är avgörande eftersom den leder MAP kinaskaskad som indirekt aktiverar oocytmognad. Faktiskt, som svar på progesteron, är polyadenylering av mos-mRNA förbättras genom en process som involverar Aurora A / EG2 regulatoriska proteiner och andra RNA-bindande proteiner med the 3'UTR av mos-mRNA. Denna ökade polyadenylering av mos-mRNA leder till en ökning av mos proteinnivå, vilket i sin tur aktiverar MEK1. Denna process medierar aktivering av extracellulära signalerreglerade kinas 2 (ERK2) (Figur 1). Detta signalkaskad kan sedan utlösa mognaden M-fas befrämjande faktorer, ett komplex bildat av Cyklin B och Cdc2 kinas, och så småningom resulterar i meiotisk återupptagande.
Därför i Xenopus laevis oocyter, kan studiet av moderns mRNA såsom mos lätt användas för att testa deras översättbarhet med flera ändpunkter från effektiv polyadenylering till översättning av flera mos signalering komponenter, däribland även fastställandet av GVBD takt. Detta system är därför intressant att utvärdera de första följderna av mutationer i translationsinitierings- faktorer utan inblandning av nyligen transkriberade mRNA eller av transfektionseffektivitet, problem som ofta uppstår med eukaryotiska cellstudier.
Här är ett protokoll som upprättades där muterade eIF4G1 mRNA injiceras i Xenopus laevis oocyter och översättning av moderns mRNA testas. I närvaro av en defekt i GVBD progression, mos mRNA polyadenylering som är nödvändig för progression genom äggcellen meiotiska cellcykeln och för efterföljande översättning av tidiga och sena klass mRNA konstateras. Fosforyleringen Aurora A / EG2 och ERK är också studeras för att bekräfta konsekvensen av MOS deregulation.Thus, Xenopus oocyter utgör ett enkelt sätt att analysera olika stegen i mRNA-translation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla Xenopus experiment utfördes på djuranläggningen i Lille 1 University i enlighet med reglerna i Europeiska gemenskapen rådets riktlinjer (86/609 / EEG) för laboratorie djurförsök. Djuret Protokollet godkändes av den lokala Institutional Review Board (Comité d'Ethique en Experimenterande Animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).
1. Oocyte Hantering
- Förbered bedövningsmedel lösningen: Lös 1 g tricaine metansulfonat pulver i en 1 L sterilt vatten.
- Plunge kvinnliga Xenopus laevis i denna lösning, täck bägaren att undvika flykt och vänta cirka 45 minuter för djuret att vara helt sövd (utan reaktion på ett ben nypa).
- Tvätta grodan med tvål och skölj med kranvatten och placera djuret på rygg på ren aluminiumfolie.
- Kläm huden på den laterala delen av buken och på äggstockarna nivå med pincett.Gör ett snitt på approximativt 1 cm med sax rengöras före användning med etanol 70%. Se till att sektionen är tillräckligt djup och att nå underliggande bukväggen för att möjliggöra excision av äggstocksvävnad där flera ägg i olika stadier av utveckling finns.
- Dissekera äggstocks loberna, tvätta dem 4 gånger i en petriskål (50 mm) med ND96-medium (96 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES justerat till pH 7,4 med NaOH, som kompletterats med 50 | j, g / ml streptomycin / penicillin, 225 | ig / ml natriumpyruvat, 30 | ig / ml sojabönstrypsininhibitor, 1 | il / ml tetracyklin) för att avlägsna alla spår av blod och skräp.
Obs: Tetracyklin tillåter en optimal bevarande och en bra återhämtning efter mikroinjektion behandling. - Förvara dem i en täckt petriskål nedsänkt i mediet vid 14 ° C, vilket gör att deras bevarande i en vecka.
- Sy bukväggen och huden med veterinär absorberbar thread och suturering nål (3 eller 4 stygn kommer att krävas).
- Placera djuret i en bägare utan vatten och fukta huden med kranvatten tills grodan rör sig igen. Täck över bägaren för att förhindra flykt.
- Separera noggrant äggstocks lober i mediet i grupper om 5 till 10 ägg genom att använda 2 par pincett under ett stereomikroskop med en 10 gångers förstoring. Välj äggceller på scenen VI. De kan kännas igen av i) deras form och färg med en brun pigmenterad djur pole och gult vegetativa polen åtskilda av en klar rem ii) deras storlek överlägsen 1,2 mm i diameter 10.
- Inkubera de valda oocyter i en kollagenaslösning (1 mg / ml kollagenas A från Clostridium histolyticum, upplöst i ND96 utan tetracyklin) i en petriskål under försiktig omrörning under 45 minuter för att underlätta oocyt defolliculation (kollagenas digererar oocyt / follikulära cellanslutningar). Skölj ägg 3 eller 4 gånger med ND96 mediet hölls vid 14° C.
Obs! Ta inte ruvar oocyter mindre eller mer än 45 minuter på grund av risken att förstöra äggcellen ytproteiner och orsaka dålig lönsamhet. Kollagenas behandling kan framkalla spontan GVBD. - Inkubera ägg i mediet för 3-4 timmar. Ta follikelceller med fina pincett i kikare förstoringsglas och hålla dem vid 19 ° C i ND96 medium.
2. Framställning av mRNA-syntes
- Linjärisera 5 ug av följande plasmider genom enzymatisk digerering med användning av Pmel enzym.
OBS: pcDNA6.2 / V5-DEST som innehåller en 1599 aminosyror eIF4G1 cDNA vildtyp (eIF4G1-WT, NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST innehåller en eIF4G1 dominant negativ cDNA (eIF4G1-DN) med mutationer c.2105T > G c.2106A> C c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - och c.2126T> G i området för växelverkan mellan eIF4G1 och eIF4E vid position 612 till 618 av det motsvarande proteinet störa interaktion betwesv eIF4G1 och eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP innehållande kloramfenikolacetyltransferas (GFP). Bered 2 blandningar för var och en av de 3 plasmider: den första inklusive Pmel enzym och den andra utan enzym som kontroll. - Fällning plasmid-DNA med användning av en klassisk etanolförfarandet och återsuspendera det i 20 pl nukleasfritt H2O
- Bestämma dess koncentration med hjälp av en spektrofotometer. Koncentrationen bör vara överlägsen 150 ng / l för att transkribera cRNA.
- Kör 1 il prover och sina kontroller med 5 il laddningsbuffert på en 0,8% agarosgel för att kontrollera plasmiden arise.
- Använd ett kit för in vitro-transkription och cRNA rening enligt tillverkarens instruktioner. De transkriberade cRNA resuspenderas i 20 pl nukleasfritt H2O Prover kan förvaras vid -80 ° C om så behövs.
- Förbered migrationsbufferten MOPS 10X innehållande 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mM natriumacetat och 10 mM EDTA (pH 8,0). Sterilisera lösningen med en 0,45 pm filter. Stock lösningen skyddas från ljus vid RT för att undvika lösning oxidation.
- Rengör elektroforestanken successivt med NaOH, HCl och sköljas grundligt med dubbel filtrerat vatten för en O / N för att undvika RNas och förhindra RNA nedbrytning.
- Kasta en 1,5% agarosgel innehållande MOPS och formaldehyd. Varm till fullständig agaros upplösning och låt den svalna till 55 ° C. Enligt dragskåp, tillsätt 0,1 volym av MOPS 10X, 6,6% formaldehyd och 4 | j, g av etidiumbromid (10 mg / ml). Häll gelen under dragskåp och vänta ungefär en timme för gelén att hårdna.
Obs: Formaldehyd och Etidiumbromid är giftiga. - Förbered prover för migration i en 0,2 ml rör med 1 ni av cRNA, 8,8% formaldehyd, 60% formamid och 0,1 volym av MOPS 10X. Inkubera under 3 min vid 70 ° C och sätta rören på is under 10 minuter. Centrifugera prover några sekunder vid5000 X g. Tillsätt 2 | il gelladdningsbuffert.
Obs: Formamid är giftigt. - Kör prover för 20 min vid 90 V. Blötlägg gel i nukleasfritt H 2 OO / N för att avfärgning gelen innan de analyserar den för att kontrollera cRNA kvalitet.
- Bestäm cRNA koncentration med användning av en spektrofotometer och lagra dem vid -80 ° C.
3. Mikroinjektion av syntetiserade RNA och oocyter Mognad Stimulering
- Förbered nödvändig utrustning för äggceller mikroinjektion. Använd en mikropipett avdragare för att dra litet glas kapillär. Under stereomikroskop, bryta av änden av kapillär med pincett för att skapa en trubbig ände. Fyll kapillären mikropipett med mineralolja under användning av en 1 ml spruta med ett Millipore 0,45 pm filter vid den motsatta änden. Montera mikropipett på mikroinjektion pipett. Välj en noggrann mikropipett kalibreras av tillverkaren för att ge god noggrannhet när den används med lämplig glaskapillär.
- Utför mikroinjektion 1-2 timmar efter defolliculation nödvändig fördröjning för äggcellen återhämtning på oocyter hölls vid 14 ° C. Använd petriskålar med botten skrapas med pincett för att skapa en vidhäftande yta för ägg och fylla dem med ND96 medium.
- Ordna ägg längs en skrapade körfält i en petriskål som tillåter en successiv injektion av oocyter med kapillär mikropipett i en vinkel på 45 ° C.
- Injicera i oocyten ekvatorialzon, under det pigmenterade djurområdet för en optimal diffusion av prover i cytoplasman. Sätt bara den tunnaste delen av kapillärspetsen på cirka 150-200 um djup.
- Injicera 30 ng cRNA erhållet från respektive olika plasmider i en volym av 60 nl i en första oocyt. Efter injektion, vänta 5-10 sekunder innan du tar bort kapillärspetsen att undvika prov escape (Figur 2A).
Obs: Överskrid inte 120 nl. Injicera så långsamt som möjligt. En kontroll med destillerat vatten rekommenderas. - Flytta manuellt petriskålen att injicera nästa äggcellen.
Obs: Se till att spetsen inte är tilltäppt genom att generera en liten puls ur badet lösningen efter 2 till 3 microinjections. - Överför injicerade oocyter i 24 brunnar odlingsplattor (10 oocyter / brunn) fylld med 3 ml färskt ND96 medium och lämna dem vid 19 ° C.
- Inkubera oocyter i ND96 med progesteron (PG) (2 | ig / ml) för att utlösa meiotisk mognad (GVBD) vid 19 ° C, 15 h eller 4 h efter mikroinjektion av polyadenylerade CRNAs erhållna respektive från pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 och pcDNA6 0,2 / C-EmGFP användes som en kontroll (Figur 2A).
Obs: Co-injektion av fluorescerande markör med cRNA är ett trevligt verktyg för att säkerställa att cRNA injicerades och förblev i äggcellen. Utföra sådana preliminära experiment med en cRNA av intresse med en GFP-tagg. - Mikroinjicera såsom i # 3,5 olika förhållanden (1: 3; 2: 2; 3: 1) av polyadenylerat eIF4G1-WT och eIF4G1-DN CRNAs för att test omräkningseffekten av eIF4G1-WT CRNAs på mutantfenotypen (figur 2D).
4. Germinal Vesikel Fördelning Fastställande
- Räkna antalet mogna ägg efter PG stimulering genom att observera närvaron av en vit fläck på den svarta djur polen med ett stereomikroskop. Upprepa räkneorganet varje timme tills tjugofjärde timme (Figur 2B, 2C).
5. Western Blot (WB) Analys
- Homogenisera den grupp av 10 oocyter från fram och tillbaka rörelser med en mikropipett spets, vid 4 ° C i 200 ^ i följande buffert: 50 mM Hepes, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% SDS, 5 mM MgCl2, 1 mg / ml bovint serumalbumin, 10 mg / ml leupeptin, 10 mg / ml aprotinin, 10 mg / ml trypsininhibitor från sojaböna, 10 mg / ml bensamidin, 1 mM PMSF, 1 mM natriumvanadat.
- Centrifugera prover för 15 min vid 10000 xg för att avlägsna lipiden (övre fasen) och membranet (bottenfasen) fractions. Samla den cytoplasmatiska fraktionen, lagra en alikvot för att bestämma proteinkoncentration och fylla det kvarvarande med Laemmli eller en bis-Tris-provbuffert (1: 1).
Obs: Bis-Tris-geler och laddningsbuffert har ett mer neutralt pH som skyddar proteiner från hydrolys - Värm 20 mikrogram av provet vid 95 ° C under 10 minuter. Ladda varje prov i brunnarna hos gelén akrylamid. Placera gelén i en tank med lämplig buffert.
- Gör en elektrofores under 1 h vid 200 V.
- Förverkliga en WB i TBS pH 8,0 (Tris-HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, innehållande 10% bovint serumalbumin) med en get-anti-Aurora A / EG2 (1: 3000, 2 h) eller med ett kanin anti -Aurora A / EG2-P (1: 1000, O / N vid 4 ° C), mus-anti-ERK2 (1: 3000, 2 h), get-anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 h ), kanin-anti-mos (1: 5000, 4 h), kanin-anti-GFP (1: 3000, 2 h) antibodies.Use antikroppar mus-anti-V5 (1: 10.000, 2 h) och kanin-anti-Rsk (1 : 1000, 2 h) (som last kontroller).
- Tvättamembranet 3 gånger under 10 minuter i TBS-Tween och inkubera 1 timme med antingen en anti-mus eller anti-kanin eller anti-get (IgM) pepparrotsperoxidas-märkt sekundär antikropp vid spädningar av 1: 5000, 1: 7500 och 1 : 5000 respektive.
- Utför 3 tvättar av 10 min i TBS-Tween och detektera antigen-antikroppar komplex med Advanced ECL Detection-systemet.
6. polyadenylerings-analys
- Prov 5 ägg per tillstånd i en 1,5 ml. Tvätta dem med 1 ml nukleasfritt PBS 1X (pH 7,4). Följande steg kommer att göras i dragskåp.
- Utdrag RNA med hjälp av en klassisk organisk förfarande (se tillverkarens instruktioner).
- Återvinna RNA genom centrifugering (10000 xg) under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och lufttorka-RNA under 10 minuter.
- Resuspendera RNA pelleten i 30 pl nukleasfritt H2O
- Ta 15 | il prov i ett nytt rör och tillsätt 85 pl av nukleasfritt H2O Städa uppSE prover för att förbättra kvaliteten på silika kolonn enligt tillverkarens instruktioner. Eluera RNA med användning 30 pl nukleasfritt H2O
- Kör 1 ul av prover med 5 ^ il laddningsbuffert på en 0,8% agarosgel för att kontrollera RNA-integritet.
- Bestäm RNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer.
- Bered 2 ligeringsblandningar per betingelse (dvs. eIF4G1-WT, eIF4G1-DN och H 2 O-kontroll) med följande reagens: 10 U av RNA-ligas, 0,1 volym av 10X buffert, 1 mM ATP, 10% av PEG8000 50% , 0,1 fig av primer P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 och bringa den slutliga volymen till 10 | il med nukleasfritt H2O Lägg i den första blandningen RNA erhållet från oocyter utan PG stimulans och i den andra blandningen RNA erhållet från PG stimulerade oocyter.
- Inkubera i en timme vid 37 ° C och sedan under 20 minuter vid 65 ° C för att inaktivera enzymet.
- Ossea-cDNA Omvänd transkription (RT) kit. Förbered RT blandningen, per rör: 0,1 volym av 10X RT-buffert, 0,1 | j, g av primer P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 mM dNTP blandning, 50 U av omvänt transkriptas och komplett med nukleasfritt H2O till slutlig volym av 10 | il. Tillsätt 10 | il ligeringsreaktion erhållits tidigare. Utför RT under betingelser som beskrivits av tillverkaren.
- Förbered polymeraskedjereaktion (PCR) blandning, per rör: 0,1 volym buffert 10X, 1,5 mM MgCl2, 133 | iM dNTP-blandning, 0,2 | iM specifik primer, 0,2 ^ M primer P2, 0,025 U Taq-polymeras, 1 pl av cDNA och komplett med nukleasfritt H2O till slutvolym av 50 pl. Utför PCR under följande betingelser: 50 ° C under 2 minuter, 95 ° C under 10 min, [95 ° C under 1 min, 56 ° C under 30 sek, 72 ° C i 30 sek] * 40 cykler, 72 ° C under 10 min 9. De specifika primrarna är enligt följande: mos, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histon-liknande B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyklin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyklin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- Bered en 3% agarosgel. Lägg i varje PCR-produkter 10 pl laddningsbuffert. Kör gelén med 10 pl prover vid 110 V för en optimal migrering. Analysera gel efter 10 och 20 minuter för att observera en förändring av storlek som återspeglar längden av svansen poly (A) och därmed RNA mognad vilket är en förutsättning för deras översättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinetic mognad av Xenopus oocyter och bestämning av den procentuella äggcellen GVBD efter 24 timmar av PG stimulering (figur 2B, 2C):
För att studera de translation konsekvenserna av eIF4G1-DN-mutationen, svaret på PG i Xenopus laevis-oocyter mikroinjicerade med cRNA eIF4G1-DN jämförs med eIF4G1-WT och till andra kontrollbetingelser (H2O, GFP). Kontrollerna gör det möjligt att bedöma förekomsten av äggcellen mikroinjektion oavsett vilken typ av injicerad cRNA eller eIF4G1 uttryck.
De kinetiska maturations av 10 oocyter som kännetecknas av mikroinjicerades kontrollförhållanden (H2O och GFP) liknar WT och antalet genomgå GVBD ligger mycket nära varandra vid 12 och 24 timmar efter PG stimulering (Figur 2B). Efter 24 timmar, mognad av oocyter når 95,7% för WT, 97,1% för H2O och 97,5% för GFP (Fi gur 2C). Således microinjections med H2O eller kontroll CRNAs eller eIF4G1 CRNAs har liten effekt på äggcellen meios release. Omvänt 8 timmar efter PG-stimulering, är antalet oocyter mikroinjicerade med eIF4G1-DN CRNAs genomgår GVBD fördröjd jämfört med eIF4G1-WT CRNAs (Figur 2B) .Den meios frisättning av eIF4G1-DN kontra eIF4G1-WT oocyter signifikant minskar med 85,8% och 77,4% på 12 timmar och 24 timmar efter PG stimulering respektive (figur 2C). Det är också anmärkningsvärt att 13 timmar efter PG stimulering, antalet mogna ägg når ett maximum för alla förhållanden utom eIF4G1-DN för vilka det maximala uppnås endast 20 timmar efter PG stimulering. Således, närvaron av eIF4G1-DN-mutationen leder till sämre oocyt meios frisättning jämfört med eIF4G1-WT.
Återställande av oocytmognad i närvaro av eIF4G1-DN tack vare eIF4G1-WT (Figur 2D):
_content "> För att bestämma huruvida eIF4G1-DN cRNA mikroinjektion försämrar eller blockerar oocytmognad, olika förhållanden av eIF4G1-WT och eIF4G1-DN CRNAs är co-injiceras. Under dessa omständigheter är en ökning med oocytmognad observeras som nivåerna av eIF4G1-WT cRNA höja och de av eIF4G1-DN cRNA decrease.While mognad observeras hos 17,5% av oocyter med en dos av eIF4G1-DN CRNAs, når denna procentandel 76,7% med samtidig mikroinjektion av 3 doser av eIF4G1-WT CRNAs och närvaron av en dos av eIF4G1-WT CRNAs leder till 95% av oocytmognad. Detta experiment visar att mognaden defekten hos Xenopus-oocyter mikroinjicerade med eIF4G1-DN inte är irreversibel och kan delvis återställd.Expressions mos signalproteiner som observerats på WB som en indikator på översättningsförmåga före och efter PG stimulering (Figur 2E):
Proteinnivån V5-taggen i oocyter som uttrycker eIF4G1-WT och eIF4G1-DN liknar reflekterande liknande mikroinjektion effektivitet. Nivån på Rsk protein som används som proteinladdningskontroll är också liknande under alla förhållanden före och efter PG stimulering. Expressionen av GFP-proteinet är också närvarande i oocyter mikroinjicerade med GFP-cRNA stimulerade eller ej med PG. Dessa data tyder på att mikroinjektion och överuttryck av eF4G1 inte störa översättningen av GFP. Men det är ingen GFP proteinuttryck detekteras före och efter PG stimulering i oocyter som uttrycker eIF4G1-DN. Som förväntat, är ingen endogen mos uttryck detekterbara i frånvaro av PG-stimulering. Dessutom mos uttryck observeras i eIF4G1-WT och H 2 O kontrollförhållanden efter PG stimulering i överensstämmelse med tidigare resultat som visar att överuttryck av eIF4G1-WT har små konsekvenser för endogena mos 16. Omvänt är en avsevärd minskning av mos uttryck märkbar efter PG stimulering.
Proffsettein uttryck av vissa komponenter i mos signaleringskaskad testas också. Till exempel, är Aurora A / EG2 protein agerar uppströms MOS induktion och ingen detektering av protein avreglering eller dess fosforylerade formen induceras efter PG stimulering observeras. Omvänt är en avreglering av ERK2 fosforylering inducerad av mos observerades i närvaro av eIF4G1-DN.
Dessa resultat antydde att den endogena uttryckningen av mos RNA till protein och mos beroende ERK2 aktivering påverkas av expressionen av eIF4G1-DN.
mRNA polyadenylering (Figur 2F):
Polyadenylering av flera mRNA (mos, Cyclin A1, cyklin B1 och Histone liknande B4) är nödvändiga för Xenopus oocyter meios återhämtning testades. Den utförda analysen gör det möjligt att definiera om en ökning av amplimeren storlek som motsvarar längden av poly (A) svansen av mRNA är närvarande efter PG stimulering. I själva verket, med PG stimulering tillägg av en poly (A) svans observeras under alla förhållanden, inklusive eIF4G1-DN mutation.
Figur 1. Schematisk översikt av MAPK kaskad aktivering. Vid hormonell stimulering av PG snabba förändringar i verksamheten i flera enzymer uppträder däribland Aurora A / EG2 och CPEB väg. Hyperfosforylering av Aurora A / EG2 leder till CPEB (Cytoplasmisk polyadenylering Element Bindande protein) fosforylering. Fosforylerad CPEB erkänner CPE (Cytoplasmisk polyadenylering Element) på 3'UTR av mos mRNA rekryterar CPSF (klyvning och polyadenylering specificitet Factor) och aktiverar mRNA polyadenylering av PAP (Poly (A) polymeras). PG stimulering främjar också successivt Maskin fosforylering både via inverkan av PKA och CDK1, Maskin / eIF4E dissociation och eIF4E / eIF4G1 association. eIF4G1 rekryterar tränstions initiering partners såsom PABP som interagerar med eIF4G1 och erkänner poly (A) svans. När syntetiserats, mos aktiverar MEK / MAPKK genom fosforylering, vilket i sin tur aktiverar ERK2 / MAPK genom fosforylering. Denna så kallade MAPK kaskaden är involverad i meiotiska processer genom att styra M-fasinträde kinetiska, spindel morfogenes och hämning av DNA-syntes. Kaskaden är inbäddad i en positiv återkopplingsslinga som upprätthåller proteinsyntes. Man måste konstatera att MOS är inte den enda protein begärde att få syntetiseras för GVBD aktivering, det vill säga, är cyklin B krävs att översätta för mognads prestation.
Figur 2. eIF4G1-DN mutant påverkar oocytmognad och översättning i Xenopus laevis. RNA härlett från plasmider som kodar V5-tagged eIF4G1 proteinerna (WT och DN) ärmikroinjiceras i Xenopus laevis oocyter. Efter 15 h, är mognaden av oocyter stimuleras av progesteron (PG) (Experiment utfördes minst 3 gånger och representativa resultat visas). (A) Schematicoverview experimenterande protokoll. Injektionerna av eIF4G1 och / eller GFP CRNAs representeras av pilspetsar före PG stimulering. Prover för RNA och proteiner analyser har erhållits på 2 tidpunkter (PG stimulering och i slutet av GVBD kinetisk). (B) Kinetic mognad av 10 oocyter som kännetecknas av GVBD testas under 24 timmar efter PG stimulering. En fördröjning av oocytmognad observeras i oocyter mikroinjicerade med eIF4G1-DN CRNAs jämfört med dem mikroinjicerade med eIF4G1-WT CRNAs (C) Procent av mogna oocyter 24 timmarna efter PG-stimulering (n = 4; p <0,05).. En minskning av oocytmognad observeras i de mikroinjicerade med eIF4G1-DN CRNAs jämfört med eIF4G1-WT CRNAs. (D) Reversion fenotyp bedömning av oocyter mikroinjicerade med eIF4G1-DN muterade CRNAs och eIF4G1-WT CRNAs visar att översättnings maskiner fortfarande fungerar när eIF4G1-WT läggs till mutanten. (E) Proteiner extraheras från oocyter och deras nivåer bestämdes genom immunanalys . Störningar av ERK2 fosforylering, mos och GFP uttryck i eIF4G1-DN villkor observeras. (F) polyadenylering av mos, cyklin A1, Cyklin B1 och Histon liknande B4 mRNA från oocyter stimuleras eller utan PG observeras efter PCR-förstärkning och migration 3% agarosgel. Efter PG stimulering, en ökning i storlek> 100 polyadenylering upptäcks i alla förhållanden. Den första banan motsvarar stegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Översättning är en mekanism som är involverad i fysiopatologin av talrika humana störningar inklusive flera neurodegenerativa sjukdomar. Till exempel vid Parkinsons sjukdom flera rapporter föreslog försämring i översättning i samband med ärftliga mutationer 8,12,13.
Flera cellulära modeller finns tillgängliga för att studera översättning. Här, i syfte att studera de translation konsekvenserna av en mutation i eIF4G1 som fungerar som dominant negativ mutation reducerar interaktionen mellan eIF4G1 och eIF4E partner 8, Xenopus laevis oocyt används. Denna modell har fördelen av enkelhet eftersom det består av endast en enda gigantisk cell lätta mikroinjektion av syntetiskt mRNA, vilket leder till en avsevärd mängd av material för biokemiska experiment och underlätta makroskopiska observationer av de olika faserna i oocytmognad. Denna process är också tidseffektivt jämfört med stabil cellline generation. Dessutom har flera protokoll av äggcellen förberedelse och RNA microinjections redan beskrivits i synnerhet för att studera cellcykeln eller nucleocytoplasmic transport 14,15. När det gäller gränserna för sådana protokoll för att studera översättning, bör särskild uppmärksamhet tas om koncentrationen av mRNA. Denna koncentration bör inte vara för hög (ej högre än 30 ng i 120 nl maximum) för att inte mätta översättningsprocessen. Med hänsyn till denna faktor, är Xenopus oocyt en attraktiv modell för att studera proteintranslation som styrks av data som presenteras i figur 2 med en muterad form av EIF4G1 transkript.
I själva verket, i närvaro av den muterade eIF4G1 är försämring i översättningen av mos protein observeras och korreleras med en minskning på 90% av GVBD jämfört med WT och kontrollera villkor. Omvänt, gjorde överuttryck av eIF4G1-WT inte leda till ändringar av nivån of mos översättning i överenskommelse med litteraturuppgifter 16,17.
Flera biologiska modifieringar kan förklara dessa resultat. Att veta att MOS mRNA är av moderdjuret och redan transkriberas före meios aktivering av PG bör störda mekanismen inträffa mellan transkription och translation steg. Anmärkningsvärt, mos översättningen är resultatet av en kaskad av molekylära händelser som börjar från en latent mRNA utan poly (A) svans på tillsatsen av svansen efter PG-stimulering till dess översättning 18,19. Således, flera scenarier är möjliga inklusive: defekter i translationsinitiering kan misstänkas vara orsaken till detta misslyckande, eller defekter i fosforylering av faktor som leder till MOS mRNA polyadenylering eller utebliven mRNA polyadenylering av MOS-transkript i sig skulle kunna leda till en translationell minskning.
För att bedöma de senaste 2 mekanismer, är uttrycket av dessa faktorer av WB undersökas. Uttryckion nivåer av fosforylerad Aurora A / EG2, som ansvarar för CPEB fosforylering visade inga störningar i närvaro av den muterade eIF4G1. På samma sätt är mos mRNA polyadenylering eller annan mRNA polyadenylering observerades i närvaro av den muterade eIF4G1 efter PG stimulering (Figur 2F). För att ytterligare bekräfta polyadenylerings- profilen Northern blot-experiment kan rekommenderas liksom att utföra sukrosgradient isolering av polysomer för att fastställa huruvida rekryteringen av mRNA till ribosomen kan ske 16.
Så, genom att studera de första och sista delarna av kaskaden var störda skede misstänks vara nedströms om förekomsten av polyadenylering. Det är också viktigt att testa om mos uttryck felet gav den förväntade effekten på fosforyleringen av ERK2. I närvaro av mutationen, minskning av mos uttryck ledde till en minskning av fosforylerad ERK2 nivå och följaktligen en defekt iden GVBD progression (Figur 1 och 2E). Således är eIF4G1 mutation associerad till en förväntad minskning av mos översättning. Strykningen av eIF4E bindande domänen i eIF4G1 sekvens i eiF4G1-DN är troligen ansvarig för en minskning av eIF4G1 / eIF4E interaktioner som tidigare föreslagits av en co-immunoprecipitation studie 8 som kan störa eIF4F komplexbildning.
Detta protokoll har flera intressanta tillämpningar inom cellbiologi. Upplägget är idealisk som förundersökningar för ett antal grundläggande frågor i cellbiologi såsom: att bättre förstå vilken roll specifika domäner om inledande faktorer, och att definiera dem som är väsentliga för in vivo översättning eller oocytmognad. I detta sammanhang Wakiyama et al., (2000) visade att det är viktigt i oocytmognad av den aminoterminala regionen av eIF4G1 innehållande de bindande domäner för eIF4E och PABP 17; att studera splicning om inledande faktorer 20; att dechiffrera de mekanismer som används av virus kapa värdöversättnings maskiner för sina syften via eIF4G1 klyvning till exempel med hämning av cap-beroende översättning och IRES strukturer av deras mRNA, översatt i cap-oberoende sätt 21; att studera betydelsen av mutation i översättnings faktorer cellcykeln eftersom oocyter är modeller av valet för sådan studie 22; att studera de huvudmekanismer som styr initiering av translation dvs att cap-beroende och locket oberoende definiera om ett eller flera system är inblandade i en proteinsyntes störning. Flera variationer av det nuvarande protokollet skulle lätt kunna användas för att nå dessa mål, däribland fastställandet av effektiviteten översättning Sunset method23 eller reporter-mRNA mikroinjektion. Exempelvis användningen av en bicistronisk rapportör-mRNA innehåller en första cistron där Renilla-luciferas kommer att locket beroende översattmedan den andra cistron innehåller Firefly luciferas kommer att översättas via IRES strukturer bör göra det möjligt att definiera läget om inledande att lägga fram fina defekter och / eller ersättningar för att upprätthålla översättnings homeostas. Dessutom är sådana luciferas reporter RNA experiment har fördelen att inte förlita sig på potentiella Disrupting utvecklings specialiserade mekanismer på grund av ofullständiga bevarandemekanismer med människa.
Parallellt med dessa grundläggande frågor, skulle ett sådant protokoll appliceras som ett första steg för att ta itu med skadliga förhållanden som kan bidra till neurologiska störningar. I fysiologiska förhållanden, translationsinitierings- steg är privilegierade mål förordningar under stressade förhållanden såsom oxidation, hypoxi, temperaturförändringar, bestrålning och näringsämnen deprivation. Under sådana förhållanden, en selektiv översättning av transkript som kodar för proteiner som är viktiga mot påfrestningar och cellöverlevnad sker.När denna process är överväldigad, spänningar blir patologisk och aktivt delta i utvecklingen av flera neurologiska åkommor. Cellulära stressorer är involverade i ett flertal neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers och Parkinsons sjukdomar, amyotrofisk lateralskleros eller prionsjukdom (Creutzfeldt-Jakobs) 24 och dessa spänningar inducerar aktiveringen av Uppvecklat proteinsvar (UPR). En av dessa UPR mekanismer leder till en minskad översättning via PERK aktivering och fosforylering av eIF2α subenhet med följderna av att stoppa översättning genom att förhindra bindning mellan eIF4F och 43S komplex 25. I Xenopus oocyter, tillsats av oxidationsmedel och / eller muterade gener som är kända knytas till sådana patologier skulle efterlikna dessa spänningar och fastställa huruvida de muterade gener kan påverka processerna översättnings. Vid Parkinsons sjukdom till exempel införandet av eIF4G1 p.R1205H i Xenoposs äggcellen associerade eller inte oxidativ stress eller genomet hela analysen av mRNA polysomal profiler kunde ta upp frågan om översättnings medverkan i physiopathology 26.
Alla dessa ansökningar tillämpas på äggcellen representerar sålunda ett stort fält av möjligheter att studera översättnings störningar som nu är kända för att vara associerade till flera känslor bland annat neurodegenerativa sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N.
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N.
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
