Summary

عزل الخلايا الجذعية العصبية / السلف من المنطقة المحيطة بالبطين في الجرذان الكبار والحبل الشوكي البشري

Published: May 14, 2015
doi:

Summary

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Abstract

الفئران البالغين والحبل الشوكي الخلايا العصبية الجذعية البشرية / السلف (NSPCs) مثقف في النمو التخصيب عامل المتوسطة يسمح لانتشار متعدد القدرات، تجديد الذات، والخلايا الجذعية العصبية قابلة للتوسيع. في ظروف المصل، وهذه NSPCs متعدد القدرات تفرق، وتوليد الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes. وفصل الأنسجة التي تحصد إنزيمي في محلول غراء-EDTA ثم فصلها ميكانيكيا وفصل من خلال التدرج الكثافة متقطع لتسفر عن تعليق خلية واحدة وهي مطلية في المتوسط ​​neurobasal تستكمل مع عامل نمو البشرة (EGF)، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF )، والهيبارين. الفئران الكبار NSPCs الحبل الشوكي هي مثقف كما neurospheres التعويم الحر والكبار NSPCs الحبل الشوكي وكما نمت الثقافات ملتصقة. في ظل هذه الظروف، NSPCs الحبل الشوكي الكبار تتكاثر، علامات صريحة من خلايا السلائف، ويمكن توسيعها باستمرار على المرور. هذه الخلايا يمكن به درس في المختبر استجابة لمؤثرات المختلفة، ويمكن أن تستخدم العوامل الخارجية لتعزيز تقييد النسب لدراسة العصبية تمايز الخلايا الجذعية. متعددة القدرات NSPCs وذريتهم كما يمكن زرعها في مختلف النماذج الحيوانية لتقييم إصلاح التجديدي.

Introduction

NSPCs هي خلايا متعددة القدرات ملتزمة النسب العصبية التي يمكن أن النفس تجديد وتوسيع بسهولة في المختبر. نشير إلى هذه الخلايا كما يسكنها خليط من الخلايا الجذعية / السلف العصبية لأنها عرض خصائص الخلايا الجذعية متعددة القدرات تجديد الذات والأسلاف أكثر تقييدا. تم العثور على NSPCs في كل من دماغ الجنين والكبار والحبل الشوكي 1،2. في البالغين، NSPCs عادة ما تكون هادئة ويقيمون في قطاعات محددة بما في ذلك منطقة subventricular بطانة البطينات الجانبية 2-4، والمنطقة المحيطة بالبطين المحيطة القناة الوسطى من 5،6 الحبل الشوكي.

عادة، NSPCs يتم تربيتها كما neurospheres التعويم الحر أو الطبقات الوحيدة ملتصقة كما هو الحال في المصل خالية المتوسطة تستكمل مع EGF bFGF و، mitogens الذي حدد للسكان الخلايا الجذعية / السلف. مقايسة neurosphere ضعت أصلا من قبل رينولدز وفايس هو الأكثر شيوعا في الثقافة وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية. عرض NSPCs multipotency عندما ومطلي انهم في النمو خالية من عامل مصل، التفريق إلى الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes. متعددة القدرات، NSPCs تجديد الذات يمكن أن تكون معزولة ومثقف من القوارض الكبار الحبل الشوكي عندما يتضمن الأنسجة مثقف مناطق القناة المركزية 6،7. وهناك ميزة محتملة في استخدام NSPCs المتولدة من الحبل الشوكي الكبار بدلا من توليد خلايا من مناطق أخرى هي أن هذه الخلايا الأنسجة محددة تشبه بشكل وثيق خلايا في النخاع الشوكي التي فقدت أو تضررت بسبب الإصابة أو المرض.

وأظهرت الأعمال السابقة التي neurospheres المستمدة من الكبار الحبل الشوكي البشري لا يمكن نشر على المدى الطويل أو passaged لتوليد عدد كاف من الخلايا 8،9. ومع ذلك، مع بعض التعديلات في ظروف زراعة، أبلغنا توسيع وزرع NSPCs الحبل الشوكي المستمدة الإنسان البالغ، مما يدل على تجديد الذاتوNSPCs متعدد القدرات يمكن عزلها عن الكبار الحبل الشوكي البشري من الجهات المانحة زرع الأعضاء 10. في المقام الأول، وإزالة معظم المادة البيضاء خلال تشريح وزراعة هذه الخلايا على الركيزة ملتصقة في النمو التخصيب عامل الوسيطة المحددة لتكاثر الكبار NSPCs الحبل الشوكي. في هذا البروتوكول وصفنا حصاد الحبل الشوكي من الفئران الكبار والجهات المانحة زرع الأعضاء البشرية، تشريح الأنسجة المحيطة بالبطين، والعزلة، والثقافة، وتوسيع NSPCs.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية الحيوان لشبكة الصحة جامعة، تورونتو ON كندا، وفقا للسياسات التي أنشئت في دليل لرعاية واستخدام حيوانات التجارب من قبل المجلس الكندي للرعاية الحيوان مستعدة. لحصاد الأنسجة النخاع الشوكي الإنسان، تم الحصول على موا?…

Representative Results

سوف الفئران الكبار خلايا النخاع الشوكي نمت في الثقافة تعليق في EFH المتوسطة تشكل neurospheres صغير (مستعمرات الخلايا غير المتمايزة) ضمن 1 أسبوع من الطلاء الأولي. في الثقافات الأولية، فإن معظم الخلايا مطلي يموت ونمو الخلايا الجذعية عامل تستجيب سوف تتكاثر ويتم اختيار لفي المت…

Discussion

خلال تشريح الفئران الحبل الشوكي الرعاية الأنسجة ينبغي أن تؤخذ على عدم الإضرار الحبل الشوكي أثناء أداء الثقب. فمن الأسهل لعزل الأنسجة المحيطة بالبطين عندما شرائح النخاع الشوكي سليمة. شرائح الأنسجة ينبغي أن تكون مغمورة تماما في المخزن تشريح والسحايا المغطي والمادة ا?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Materials

1X PBS Life Technologies #10010023 Dissection buffer
1X HBSS Life Technologies #14175095 Dissection buffer
D-glucose Sigma # G-6152 Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140-148 Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A  Life Technologies #10888-022 Culture medium
L-glutamine, 200mM Life Technologies #25030-081 Culture medium
B27 Life Technologies #12587010 Culture medium
DMEM Life Technologies #11885084 Hormone mix
F12 Life Technologies #21700-075 Hormone mix
NaHCO3 Sigma # S-5761 Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES Sigma #H9136 Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin Sigma #I-5500 Hormone mix
Apo-transferrin Sigma #T-2252 Hormone mix
Putrescine Sigma # P7505 Hormone mix
Selenium Sigma #S-9133 Hormone mix
Progesterone Sigma #P-6149 Hormone mix
EGF, mouse Sigma #E4127 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant Sigma #E9644 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant Sigma #F0291 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium 
Heparin, 10000U Sigma #H3149 Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit Worthington Biochemicals #LK003150 Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital Bimeda – MTC Animal Health Inc DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons Fine Science Tools #11006-12  Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4 Fine Science Tools #11241-30
Microscissors Fine Science Tools #15024-10 Round-handled Vannas
Rongeurs Bausch & Lomb N1430
10mm Petri dishes  Nunc 1501
T25 Culture flasks Nunc 156367
40 μm nylon cell strainer VWR CA21008-949
6 well plates Nunc CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100X) Corning 354230 Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM

Referencias

  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  4. Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
  6. Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
  7. Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
  8. Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
  9. Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
  10. Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
  11. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  12. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
  13. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  14. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
  15. Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
  16. Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
  17. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
  18. Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).

Play Video

Citar este artículo
Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord. J. Vis. Exp. (99), e52732, doi:10.3791/52732 (2015).

View Video