In vivo ההדמיה ומעקב של טכנציום-99m תווית תאי גזע מח העצם mesenchymal בסוסי Tendinopathy
Summary
This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.
Abstract
התקדמות ביישום של תאי גזע mesenchymal מח עצם (BMMSC) לטיפול בפציעות גיד ורצועה בסוס מציעה שיפור מדדי תוצאה בשני מחקרים ניסיוניים וקליניים. למרות BMMSC מושתל לתוך נגע הגיד במספרים גדולים (בדרך כלל 10-20,000,000 תאים), רק מספר קטן יחסית לשרוד (<10%) אם כי אלה יכולים להימשך עד 5 חודשים לאחר השתלה. זה נראה תצפית נפוצה במינים אחרים שבי BMMSC כבר מושתלת לתוך רקמות אחרות וזה חשוב להבין, כאשר אובדן זה מתרחש, כמה לשרוד את תהליך ההשתלה הראשוני והאם התאים נמחקים לאיברים אחרים. מעקב הגורל של התאים יכולים להיות מושגת על ידי radiolabeling BMMSC לפני ההשתלה שמאפשרת לא פולשנית בהדמיה vivo של מיקום תא וכימות של מספרים סלולריים.
פרוטוקול זה מתאר labeli תאהליך ng המשתמש בטכנציום-99m (TC-99m), ומעקב של תאים אלה לאחר השתלה לגידים המכופפים נפצעו בסוסים. TC-99m הוא איזוטופ קצר (t 1/2 של 6.01 שעות) שפולט קרני גמא ויכול להיות מופנם על ידי תאים בנוכחות oxime מתחם lipophilic hexamethylpropyleneamine (HMPAO). תכונות אלו הופכות אותו אידיאליים לשימוש במרפאות רפואה גרעיניות לאבחון של מחלות רבות ושונות. גורלם של התאים שכותרתו ניתן בעקבות בטווח הקצר (עד 36 שעות) על ידי מיפוי גמא לכמת הן את מספר התאים נשמרו בנגע וההפצה של התאים לתוך ריאות, בלוטת התריס ואיברים אחרים. טכניקה זו מותאמת התיוג של כדוריות דם לבנות בדם ויכולה להיות מנוצלת לתמונה המושתלת BMMSC באיברים אחרים.
Introduction
אסטרטגיות משובי לתיקון רקמות חולות או פגומות מבוססות על תאי גזע multipotent נגזרים ממגוון רחב של רקמות ומושתלים לתוך האזור הפגוע. התקדמות ביישום של BMMSC אוטולוגית לטיפול בגיד ופציעות רצועה בסוס הראו אמצעים השתפרו תוצאה בשני 1-5 הניסיוניים ומחקרים קליניים 6. הסוס הוא מודל אטרקטיבי במיוחד להערכת היעילות של תאי גזע הקשורים טיפולים כי היא סובלת מגיל ולמתוח יתר על המדה פציעות הקשורות לגידים של forelimb דיסטלי, זה בעלי חיים ספורטיביים, וזה התאוששות גדולה, להקל על מח עצם ו השתלה מדויקת. פציעות גיד להחלים באופן טבעי עם סיסטיק אבל הגיד נרפא מבחינה פונקציונלית נחותה 7 ויש לו סיכון גבוה לפגיעה מחדש 8. הגיד המכופף הדיגיטלי השטחי (SDFT) המושפע ביותר בכינויו זה התפתח לפעול כאנרגיה אלסטיתחנות וחוויות גבוהה טעינה מדגישה להשיג אנרגיה יעילה ותנועה במהירות גבוהה. שחזור פונקציה לאחר פציעה לכן קריטי. פגיעות אלה דומות לאלה המשפיעים על גיד אכילס בבני אדם שמבצע פונקציה דומה 9. אין אפשרויות טיפול טובות לטיפול או להשיג תיקון טוב לפציעות כגון, אסטרטגיות משובי מבוססות תאים לכן מציעות הזדמנות אטרקטיבית לשיפור תוצאות ולהפחית מחדש פציעה.
במרבית המחקרים 5-20,000,000 BMMSC אוטולוגית מוזרקים ישירות לתוך הנגע שמתרחש בדרך כלל בתוך הליבה של גוף הגיד שלכן פועל ככלי קיבול לתאים. גורלם של התאים המוזרקים פעם אחת הוא לא שיטות תיוג תא ברורות ושונות כדי לעקוב אחר התאים תוארו לאחרונה. תאים שכותרתו עם תג הקרינה הוצגו לשרוד רק במספרים קטנים יחסית (<10%) 10,11. תוויות הקרינה מחייבותחילוץ רקמות וחתך לניתוח היסטולוגית שזה זמן רב ולא בקלות להקל על ניתוח זמני במודל חיה גדול או במקרים קליניים. בעבודה מאוחרת יותר השתמשנו 99m Tc הרדיו-איזוטופי לתייג תאים ועיקבו אחרי גורלם על ידי מיפוי גמא 1. שיטה זו מאפשרת השוואות מהירות להתבצע בין מסלולים השונים של משלוח תא, כוללים intralesional, תוך ורידי באמצעות וריד הצוואר 1 או זלוף האזורי באמצעות זריקות תוך ורידי או 12 1,12 תוך-עורקים. ההתמדה וההפצה של תאים ולאחר מכן ניתן הדמיה על ידי מיפוי גמא של איברים שונים. זה הוכיח כי רק 24% מהתאים המוזרקים נשארו intralesionally בנגע על ידי 24 שעות 1 וזו נתמכת על ידי מחקר אחר באמצעות נגעים נוצרו בניסוי ומשתמש באותו radiolabel 5. יתר על כן, התאים להראות יכולת המוגבלת לבית לנגעי גיד כאשר delivereD על ידי זלוף האזורי או לוריד, אבל הם התפזרו לריאות על ידי הנתיבים האחרונים 4.
BMMSC שכותרתו עם חלקיקי ברזל הוא שיטה חלופית כדי לעקוב אחר התאים מושתלים לגידי forelimb 13. למרות שתאי שכותרתו ננו-חלקיקי הברזל לאפשר מעקב תא in vivo על ידי MRI, מחקרים זמניים בבעלי חיים גדולים מוגבלים במספר הפעמים יכולות להינתן הרדמה בכל נקודה לביצוע סריקות MRI זמן. יתר על כן, חלקיקי ברזל הם hypointense על MRI אשר מגביל את המידע על ההגירה של תאים שכותרתו לתוך גוף הגיד. רדיואיזוטופים אחרים שניתן להשתמש בי כוללים אינדיום-111 אבל זה סובל חסרון של מחצית חיים ארוכים יותר מTc-99m (2.8 ימים לעומת 6.0 שעות) ואנרגיה פליטה קרני גמא גבוהה יותר. בנוסף, כדאיות תא דווחה להיות מופחתות כאשר כותרתו עם אינדיום-111 14. TC-99m, לעומת זאת, משמש באופן שגרתי בשני גרעיני סוסים ובני אדםרפואה לתייג תאי דם היקפי mononuclear ועיקבו אחרי ההפצה שלהם in vivo על ידי מיפוי. ניתן בקלות יחסית לקח את זה על ידי תאים באמצעות HMPAO כמולקולת מקשר לקשור טכנציום, כTc-99m-HMPAO, לתאים. TC-99m-HMPAO כותרת BMMSC להראות כדאיות טובה ויכול להתרבות במבחנה 4. פרוטוקול זה מפרט את התיוג ומעקב של BMMSC אוטולוגית סוסים מושתל לתוך נגעים טבעיים בSDFT forelimb.
חשוב לציין כי הפרוטוקול נועד רק כדי לשמש ככלי מחקר. השימוש בו ככלים טיפוליים קליניים אינו מומלץ כהשפעה על הפנוטיפ radiolabel סלולארי לא הובהרה במלואו.
Protocol
Representative Results
Discussion
בנוסף למח עצם, תאי גזע מבודדים ממקורות כגון רקמת שומן מתאימים לתיוג עם פרוטוקול זה. יתר על כן, תאים ממצב קפוא ניתן לתחייה והרחיבו בתרבות למספרים הרצויים ללימודי תיוג 12.
גורם קריטי הקובע את היעילות של תיוג BMMSC הוא הזמן בין elution…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Spain.
Materials
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18G and 19G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18G); NN1938R (19G) | |
| Syringes 1 mL and 2 mL | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
Referencias
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, 23-26 (1997).
- O’Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
